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灭活疫苗下游工艺概述
发布时间: 2021-01-22     来源: 制药业

2019-nCoV (新型冠状病毒)似乎像一场没有被预测到的暴风雨,迅速席卷了中国甚至全球。面对这场突如其来的疫情,人们虽然有惶恐,但是却没有乱了阵脚,逆行者比比皆是。

病毒这种古老的生物,在人类的发展史上,从来都没有缺席。迄今为止,除了2019-nCoV新冠状病毒外,还发现6种可以感染人类的冠状病毒,其中中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及2019-nCoV可引起严重症状,致死率较高。针对这一类冠状病毒还没特效药物,因此疫苗的开发显得尤为重要。随着分子生物学的不断进步,疫苗的种类也越发丰富,从传统灭活/减毒疫苗,发展到重组疫苗,病毒载体疫苗,以及核酸疫苗。新冠病毒疫苗的研发也是采取了多路并行的方式。

灭活病毒疫苗通常是指全病毒灭活疫苗,由于其含有完整病毒几乎全部的抗原成份,具有较强的免疫原性,是最具有成功潜能的疫苗路线之一。现代工艺中灭活疫苗的基本工艺路线可参考如下:


▲图1 灭活疫苗整体工艺路线

这条工艺路线涉及了从培养基准备开始直至终端制剂灌装的全流程,颇尔在该流程中各工艺点都可以提供相应的解决方案。本文仅概要介绍下游工艺中收获澄清、层析纯化、TFF浓缩及缓冲置换、除菌过滤等几个工艺点。

收获澄清


灭活病毒疫苗的生产多使用鸡胚或者贴壁依赖型细胞来繁殖病毒。无论哪种培养方式,下游工艺首先需要考虑如何有效获取培养上清液。何为有效?抗原回收率,滤出液澄清度以及处理量都是关键性能指标。针对鸡胚尿囊液或是贴壁培养细胞这类污染物水平相对不高的料液来说,颇尔可以提供多种直流过滤器,采用简单的直流过滤操作模式来完成,快速且便捷。

对于高污染物水平的病毒收获液可以选择深层过滤产品,深层过滤具有更高的容污能力。传统深层过滤产品,由于存在硅藻土和珍珠岩等助滤剂成分,对病毒类料液可能会产生吸附从而影响产品回收率。颇尔可以提供PDK11,V100P以及Bio系列的深层过滤器解决这一问题。图2比较了颇尔公司HDC II聚丙烯过滤器与V100P深层过滤器在流感疫苗病毒收获液中的表现, V100P回收率高于90%,处理量达到200L/m2。


▲图 2 V100P深层过滤器澄清效果

层析纯化

对于较大生物分子(如病毒,病毒载体,VLPs或质粒)的层析纯化,难点在于传统的层析介质孔径小,较大的生物分子难以充分接触到介质孔隙中的配基,一方面载量受限,另一方面很难有效洗脱。对此可应用颇尔的Mustang Q阴离子膜层析,其基质为0.8µm孔径的PES膜材,生物大分子可以轻松进入膜孔与配基结合(如图3),同样也容易被洗脱,保证高载量的同时可以获得较高的回收率。得益于其设计原理,Mustang Q可以耐受高达10MV/min的流速,也就是说5ml的膜层析装置即可达到50ml/min的流速,采用小体积膜在短时间内可以处理大量料液,有效提高工艺效益,降低成本。


▲图3 膜层析与传统层析原理对比

TFF浓缩及缓冲液置换

切向流过滤技术在疫苗下游工艺中被广泛应用,颇尔的T系列膜包具有高滤速、低蛋白吸附等特点,并且符合GMP要求,有完善的验证文件,保证产品符合最新法规的要求。针对剪切力敏感的病毒类产品,也可以选择单程切向流技术即SPTFF (Single-Pass Tangential Flow Filtration)。SPTFF用单向的长流路替代了传统的循环流路,显著降低了剪切力,提高了产品收率。另一方面,SPTFF的多级设计还可以满足高浓缩倍数的需求,也可以适应连续生产的需求。


▲图4. 切向流系列产品

除菌过滤

除了个别尺寸较大的病毒(如狂犬疫苗)无法实现外,对于大多数疫苗产品来说终端除菌过滤都是不可或缺的工艺。PES材质的除菌级过滤器,得益于它吸附低,速度快等优势,被广泛应用于此工艺点。而针对相对颗粒较大的病毒来说,回收率是重点关注对象,Supor® EKV以及 Supor® EX ECV ,其优异的制膜工艺显著提升膜材的容污能力,配合巧妙的打褶方式和特殊小内核设计,可以增加过滤器处理能力,顺利解决工艺难题。


▲ 图5 除菌过滤器设计特征
(A对称孔;B非对称孔;C普通打褶;
D超级打褶;E普通内核;F小内核)


结语

疫苗研发工作的最终目标都是走向临床,进入生产,并最终应用保护人类安全。开发者需要研发出安全、有效、可供的药品,尤其是疫苗这种需要被广泛应用的产品,需要在研发之初就充分考虑要做出人人用得起的药物。颇尔作为生物技术解决方案的供应商,所提供的方案均有成熟的放大产品和使用经验,可以支持药物的顺利放大生产,良好的性能有利于降低生产成本。

参考资料
1.Epidemiology, Genetic Recombination, and Pathogenesis of Coronaviruses
2.A Scalable Lentiviral Vector Production and Purification Method Using Mustang Q Chromatography and Tangential Flow Filtration
3.Improved Virus Purification Processes for Vaccines and Gene Therapy
4.Protein concentration with single-pass tangential flow filtration (SPTFF)
5.Clarification of influenza virus harvest with Seitz® depth filter sheet V100P: A compact and economical solution for maximal virus yield and robust protection of downstream purification steps(USD2971)
6.Purification of Influenza Virus by Ion Exchange Chromatography on Mustang® Q XT Membranes(USD2916)