2026年10月16日，国家药典委发布了《9251 细菌内毒素检查法应用指导原则》和《药品污染菌耐受性指导原则》的公示稿，如下：

附件 1：9251 细菌内毒素检查法应用指导原则公示稿（第 1 次）

9251细菌内毒素检查法应用指导原则

本修订草案仅涉及9251《细菌内毒素检查法应用指导原则》“5.其他”中的(6)。修订内容如下：

(6)使用重组试剂的细菌内毒素检查法：包含重组C因子法(见本指导原则“附：重组C因子法”)和重组级联试剂法，此两种方法为细菌内毒素检查法(通则1143)的补充方法。当采用重组C因子法和重组级联试剂法检测产品样品中的细菌内毒素时，应符合“凡例”的相关规定。

附：重组C因子法

C因子是鲎试剂中对细菌内毒素敏感的蛋白，能够选择性识别内毒素。重组C因子是一种人工合成的C因子，它被细菌内毒素活化后，可与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号。

本法系依据反应混合物中的内毒素浓度和其孵育终止时的荧光值之间存在量化关系来测定细菌内毒素的含量。本法为终点荧光法。依据检测原理，本法不存在G因子旁路干扰，具有较高的专属性，因此适合于含有β-葡聚糖干扰的样品检测；本法所用试剂不含有B因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此，含有对上述物质抑制或增强作用的样品适合使用重组C因子法。

重组C因子法试验需采用荧光酶标仪，其激发和发射波长等参数参照试剂的使用说明书，激发/发射波长一般为380nm/440nm,检测温度一般为37℃±1℃。

仪器灵敏度(增益值)调节、重组C因子试剂的配制方法、保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

重组级联试剂法

重组级联试剂为采用重组技术制备、非动物来源的细菌内毒素定量检测试剂，通常含重组C因子、重组B因子、重组凝固酶原。常用的重组级联试本法系利用检测重组级联试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定剂中含有显色底物，采用动态显色法。底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。依据反应原理，本法不存在G因子旁路干扰。

仪器要求和试验操作参照细菌内毒素检查法(通则1143)中的光度检测技术。

附件2:9251细菌内毒素检查法应用指导原则修订说明

依据国家药品标准提高制修订课题研究结论，修订正文“5.其他(6)”条款，收载了重组级联试剂法。参照了美国药典、日本药典对该方法的定义、原理及操作方法进行界定，指导规范使用。

将重组C因子法和重组级联试剂法统称为“使用重组试剂的细菌内毒素检查法”。

附件1:药品污染菌耐受性检查指导原则公示稿(第1次)

药品污染菌耐受性检查指导原则

无菌物品是指物品中不含任何活的微生物，其无菌特性一般通过物品中活微生物的概率来表述，即非无菌概率(PNSU)或无菌保证水平(SAL)。在药品灭菌中，污染菌的耐受性是指微生物抵抗灭菌作用的能力，可以用D值来表示。D值是指将微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量。在药品生产时，应关注污染菌的耐受性对灭菌工艺的挑战，以保证所采用的灭菌工艺能够彻底杀灭可能存在的微生物，并达到预期的无菌保证水平。

本指导原则主要用于指导湿热灭菌物品中的污染菌的耐受性检查，其它灭菌或除菌方法亦应关注微生物的耐受性并开展相关研究和评估工作，以保证灭菌工艺的有效性。

被灭菌物品的PNSU由公式(1)计算(以湿热灭菌为例)。

式中，

Nr:灭菌后的微生物数量
No:灭菌前的微生物数量
F(Tz):假设温度系数为Z,在T温度下的等效灭菌时间
Dr:微生物在温度T下的耐受性

经最终灭菌工艺处理的无菌物品的PNSU不得高于10-⁶。已灭菌物品的PNSU与灭菌后的微生物数量NF相对应。如公式(1),PNSU的值与灭菌时间、灭菌前的微生物数量以及微生物的耐受性相关。因此，在进行灭菌工艺研究、灭菌验证或日常监控时，需要对生产或检验过程中分离的污染微生物进行耐受性的监测和评估，从而证明采用的灭菌工艺能够杀灭可能存在的微生物并有一定的冗余，使被灭菌物品的PNSU达到预期。

药品污染菌的耐受性评估包括芽孢筛查、沸水浴耐热性评估以及D值测定，可以根据实际情况选择上述一种或多种方法。

芽孢筛查

芽孢筛查是通过一定程度的热处理，杀灭细菌营养体后进行培养，从而判断是否有芽孢存在于样品中。

参考非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)制备供试液(液体供试品可直接使用供试品原液)置于适当的容器内，70℃加热30min后迅速冷却，采用薄膜过滤法处理，将滤膜接种至胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，或将热处理后的供试液直接接种至适宜体积的胰酪大豆胨液体培养基中(接种量不得超过培养基总体积的10%),30~35℃培养5~7天。也可使用其它经确认的热处理和培养方法。

在进行芽孢筛查之前，应考虑待测样品抗菌活性，如有必要，参考非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)和控制菌检查法(通则1106),采用枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]或其它耐热性芽孢开展方法适用性试验。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]的芽孢悬液制备照药品微生物实验室消毒剂效力评估指导原则(指导原则9210)。

经过培养后如有菌生长，应进行分离纯化，并进行适当水平的鉴定，如判断为含芽孢的细菌，应进行沸水浴耐热性评估或D值测定。

沸水浴耐热性评估

进行沸水浴耐热性评估试验时，可以直接对供试液进行沸水浴处理，也可以采用薄膜过滤法对供试液处理后，取滤膜置液体培养基(或其他溶液)中再进行沸水浴处理。

在进行沸水浴评估试验之前，应考虑待测样品抗菌活性，如有必要，参考非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)和控制菌检查法(通则 1106),采用枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]或其它耐热性芽孢开展方法适用性试验。芽孢悬液制备同芽孢筛查。

以下沸水浴耐热性评估法可以根据实际情况进行适当调整，也可以使用其它经过验证的方法。

沸水浴耐热性评估法一

取被灭菌物品制备成供试液(或直接取待测溶液)经过沸水浴(95~100℃)加热一定时间后，采用胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基于30~35℃培养5~7天。建议进行系列时间的沸水浴处理，选取呈阳性结果最长的时间，按照表1估算其D121c值。

一般情况下，该方法得到的D121c值高于其实际值。这一情况考虑到了灭菌工艺的冗余，为灭菌工艺验证或灭菌工艺监测提供了安全保障。

表1沸水浴评估法一的D121c估计值(min)

沸水浴耐热性评估法二

本方法考虑到了初始芽孢数量，根据沸水浴处理后阳性和阴性结果的数量对121℃下的D值进行估算。以下给出计算公式（2）、一定条件下的估算结果（表2）以及试验步骤。

沸水浴处理一定时间后对应的121℃下的D值估算使用公式（2）。

式中，

D121c估计：采用沸水浴方法估计的121℃下的D值
t:沸水浴加热时间(min)
No:沸水浴加热的每管初始微生物数量(或芽孢数量)
M:进行沸水浴处理的总管数
M勇：进行沸水浴处理后呈阴性结果的管数，一般可取M=

一般情况下，为灭菌工艺的有效性提供足够冗余，应保证对D值的高估，计算时取No为表中芽孢数量的十分之一，取M总=6,M穷=1,沸水浴处理系列时间后，其D121c估计见表2。

表2沸水浴评估法二的D121c估计值(min)

取芽孢筛查或其它监测得到的含芽孢细菌，采用适宜的方法制备芽孢悬液，并进行适当的稀释，可以悬浮于灭菌纯化水(或特定溶液)中。将稀释后的芽孢悬液(或取待测溶液)置适当的容器(如玻璃试管)中，制备若干支管，于沸水浴(95~100℃)加热一系列时间后，采用胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基于30~35℃培养5~7天。根据有菌生长(即阳性结果)的最长时间和芽孢浓度查表2得到D¹21℃估计0。也可按照公式(2),根据试验管数以及阳性和阴性管数计算得到D121℃估计。

D值测定

将分离的含芽孢细菌制备芽孢悬液，置于适当的容器中。按照生物指示剂耐受性检查法指导原则(指导原则9208)的阴性分数法或残存曲线法进行D值测定。根据需求选择测试温度，通常可以选择低于121℃的温度。

附件2:

药品污染菌耐受性检查指导原则起草说明

一、目的意义

药品污染菌耐受性的研究和评估直接影响灭菌工艺的有效性，对达到一定的无菌保证水平至关重要。被灭菌物料中污染的微生物(包括芽孢)来源广泛，其对灭菌工艺的耐受性未知。以湿热灭菌为例，根据灭菌工艺的杀灭程度不同，应制定灭菌前料液中生物负载的耐热性研究策略。目前国内外标准法规都要求在灭菌工艺开发、验证和日常监控时应考虑污染菌的耐受性，但是具体的检测和评估方法仅有美国药典2025年第3版通则56“灭菌工艺过程中微生物的耐受性检测方法”收载。因此，为了指导行业开展微生物的耐受性研究和评估工作，保证灭菌工艺的有效性，国家药典委员会微生物专业委员组织起草了《药品污染菌耐受性检查指导原则》。

二、起草过程

本指导原则起草依托2024年药品标准提高项目“药品污染菌耐受性检测指导原则的研究(课题编号：2024Y17)”,由中国食品药品检定研究院牵头，上海市药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院、广西壮族自治区药品检验研究院、四川省药品检验研究院、陕西省食品药品检验研究院、宁夏回族自治区药品检验研究院、新疆维吾尔自治区药品检验研究院、广州市药品检验所、苏州市药品检验检测研究中心、苏州百特医疗用品有限公司、费森尤斯卡比华瑞制药有限公司、四川科伦药业股份有限公司等单位参与起草。课题组通过开展药典标准、文献法规比对研究；对药品生产企业进行调研；开展芽孢筛查、沸水浴耐热性评估以及D值测定的试验研究，确定了指导原则的总体框架和具体试验方法参数，形成了指导原则草稿，进一步根据行业专家的意见进行了修改，形成本指导原则公示稿。

三、总体思路

根据制药工业和检验机构的实际需求，参考美国药典2025年第3版通则56,本指导原则分为四个部分：前言、芽孢筛查、沸水浴耐热性评估和D值测定。

前言部分强调污染菌耐受性研究和评估的意义和重要性，明确药品污染菌的耐受性评估范围，包括芽孢筛查、沸水浴耐热性评估以及D值测定。

芽孢筛查部分给出了供试液处理方法、培养基、培养时间以及结果判定，同时，提醒需要考虑供试液抑菌性的去除和开展方法适用性试验。

沸水浴耐热性评估包括法一和法二。法一采用制药工业普遍采用沸水浴加热的方法，该方法与美国药典通则56收载的方法一致。法二同样是采用沸水浴加热的方法，与法一的不同之处是考虑到了初始芽孢数量，可以通过查表或公式计算得到更准确的数据。通过试验数据确认，当初始芽孢数量小于10³cfu时，法二与法一结果一致。当初始芽孢数量大于等于10³cfu时，法二较法一的估算结果更为准确。

D值测定参考生物指示剂耐受性检查法指导原则(指导原则9208)进行。

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