骨肉瘤(OS)是一种侵袭性恶性肿瘤，主要影响儿童和青年，是预后较差的转移性和复发性肿瘤。联合化疗的引入虽极大程度上改善了患者存活率，但也到达了生存改善的平台期，后续改善难度较大。由于OS的异质性和潜在靶向蛋白的脱靶情况，OS的免疫治疗难度较大，更多创新的免疫疗法亟待研发。

近日，Mensali 团队在 Nature Communications 发表了题为 ALPL-1 is a target for chimeric antigen receptor therapy in osteosarcoma 的研究。该研究验证了ALPL-1在OS中的特异性表达，且可被TP-1和TP-3抗体识别。据此构建了两种嵌合抗原受体（CAR）分子OSCAR-1和OSCAR-3，通过一系列实验证实了OSCAR-T细胞对OS的有效性，提示OSCAR-T细胞或可成为部分OS患者的细胞疗法方案。

TP-1和TP-3单克隆抗体是从接种了来自原发性肺转移OS患者人源细胞系的小鼠体内分离所得，它们对OS有选择性，对其他肉瘤的反应性较低。研究通过过表达和基因敲除实验证实了TP-1和TP-3对ALPL-1的特异性。TP-1和TP-3均对ALPL-1 cDNA转染的HEK-293细胞有反应，但对亲代细胞无反应（图1）。同时研究通过在OHS细胞（可被TP抗体染色的OS细胞系）中使用CRISPR/ CAS9技术敲除ALPL基因进一步证实该发现（图2）。


图1. TP-1和TP-3流式直方图：野生型HEK-293细胞；ALPL-1转染的HEK-293细胞（HEK-293ALPL-1）；OHS细胞


图2. ALPL-1，TP-1和TP-3流式直方图：ALPL基因敲除OHS细胞（OHSALPL KO）和OHS亲代细胞

研究人员又通过二代测序确定了ALPL-1在OS中的高表达，且通过对比在正常组织（骨，肺）及OS肺转移组织的ALPL-1表达量（图3），验证了运用TP抗体对膜蛋白ALPL-1的初步观察结果。


图3. ALPL-1在原发性(n = 9)和转移性(n = 5) OS以及正常骨(n = 24)和肺组织中表达(n = 14)

基于上述发现，研究构建了TP-1和TP-3的CAR，命名为OSCAR-1和OSCAR-3，通过生物荧光杀伤分析验证了ALPL-1的存在对OSCAR-T细胞杀伤活性的重要性（图4）。同时也通过构建异种移植小鼠模型证实了OSCAR-T细胞对控制肿瘤生长的作用（图5，6）。


图4. 用生物荧光法(BLI)测定OSCAR-1和OSCAR-3对ALPL-1阳性细胞的细胞毒性


图5. 通过BLI获得的通量值来量化每只小鼠的肿瘤进展


图6. 异种移植小鼠的Kaplan-Meier生存分析

最后，在验证了OSCARs对OS异种移植小鼠的有效性后，研究还对其进行了安全性评估。之前的免疫组化染色已经证实了ALPL-1的表达仅限于OS样本，而在健康组织中几乎检测不到（图7）。研究分离出可分化为成骨细胞的间质干细胞（MSCs），并测试OSCAR-T细胞的反应性（图8）。


图7. 用TP-3抗体对骨肉瘤和正常组织进行ALPL-1免疫组化染色结果


图8 ab. OSCAR-T细胞的细胞毒活性是通过与不同正常组织共培养的CD8(上)和CD4(下)T细胞上TNFα的产生和表达来测定的

总之，该研究在体外环境和原发性/转移性骨肉瘤原位模型中证实了CAR-T细胞对ALPL阳性细胞的细胞毒性，且对造血干细胞或健康组织没有超出预期的毒性，进一步的安全性评估还需在后续的临床研究中进行。靶向ALPL-1的CAR-T细胞在临床前模型中显示出治疗OS的效率和特异性，为将来进行OS细胞疗法的临床转化提供了依据。