RNA疗法是指使用基于RNA的分子来治疗或预防疾病。1978年，Zamecnik和Stephenson首次描述了使用合成寡核苷酸通过RNA的Watson Crick杂交来改变蛋白质表达。

经多年发展，尽管由于裸RNA的不稳定性和阻碍RNA进入细胞的生物屏障的尚有挑战，但RNA药物的许多优点，包括针对广泛的遗传分子的潜力、快速高效的生产、长效性、对罕见疾病的有效性以及可以降低遗传毒性的风险，使RNA疗法技术的开发成为一项值得的投资。

7月，一篇题为RNA-based therapeutics: an overview and prospectus的综述在Nature上进行了发表文章，针对目前RNA疗法的类型及其作用模式，并介绍了应用这些RNA疗法的关键挑战以及解决办法。

得益于研究人员在此领域的深耕，RNA分子调控因子及其相关机制也已得到很好的表征。到目前为止，已有几种经批准的基于RNA的药物和许多处于III期研究的药物。

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RNA治疗的作用模式

RNA药物主要在DNA、RNA和蛋白质三种基本的生物大分子中起作用，其靶向药物主要包括靶向RNA的小分子药物、反义寡核苷酸(ASOs)、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、RNA适配体（Aptamer）、短激活RNA（saRNA）、基因组编辑，还有外源表达递送的mRNA等。

研究人员对RNA机理的日益了解，促进了RNA的各种应用，从选择性地作用于迄今为止“不可耐药”的蛋白质、转录本和基因，到有可能拓宽治疗靶点，RNA药物在治疗疾病中扮演日益重要的角色

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ASOs

ASOs是短的单链寡核苷酸，可以与特定的RNA互补碱基配对，通过可以改变RNA，减少、恢复或修改蛋白质表达。基于不同的杂交机制，ASOs被分为占位介导降解模型和RNA降解机制模型（图3 A）。

在占位介导降解过程中，ASOs通过内源性酶结合并裂解ASO结合位点上的靶RNA，增强靶转录物的下调（图3 A①），这种由RNAseH1介导的降解机制也被称为酶促RNA降解。

RNAseH1由于无处不在的分布，很容易靶向细胞质和核转录本。其他酶，如核酶，也可以介导占位介导的降解。核酶通过锤头状或发夹状结构劈开RNA，它的底物识别域可以被修饰以进一步促进顺式或跨式位点特异性裂解。

其次，大多数情况下ASOs可通过RNaseH1或Argonaute2（Ago2）促进RNA的剪切。RNAseH1是一种内源性核酸酶，存在于大多数细胞中，促进RNA-DNA双链杂合体中RNA的切割。剪接开关ASOs可以通过靶向剪接调控顺式元件来改变剪接模式。顺式作用元件通过招募反式剪接因子激活或抑制相邻的剪接位点，它们由剪接增强剂和消减剂组成。相反，ASOs靶向一个剪切消减剂序列元素，阻止抑制剪接因子的结合。

与其他反义核酸的作用机制相似，ASOs也可通过RNA干扰途径实现RNA的降解。ASOs通过抑制miRNA介导的下调（图3 A⑤），ASOs比依赖RNAseH1的ASOs允许更多的核苷酸修饰，从而改善ASO药物的性质。

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RNAi

RNAi可以诱导双链RNA对特定RNA靶标进行降解，为对抗入侵病毒和转录因子提供内在防御机制。

siRNA可以在哺乳动物细胞中诱导RNAi，因此，研究人员可以利用这种简单的基因沉默来研究基因功能，以此推进在疾病治疗领域的应用。从机制上讲，核糖核酸内切酶切断双链RNA，并在RNA诱导RISC隔离导链和客链。AGO2蛋白降解客siRNA链，而导向siRNA链直接结合到靶向RNA上，引起AGO2介导的裂解。

miRNA是通过RNAi影响基因表达的内源性单链小RNA。首先，miRNAs由长链的一级前体miRNAs产生，由RNAseiii家族核酸酶Drosha在细胞核中裂解。然后，游离的前miRNA被运送到细胞质中，产生成熟的miRNA，并被加载到preRISC中进行链选择。两个链可能以相似的频率加载到RISC中，而不同的链的使用取决于生物环境。

在细胞核中，AGO2 saRNA利用“种子”区域与染色质结合的RNA转录本或互补DNA内的序列进行碱基配对。

除了saRNA和AGO2，最近的研究发现RNA诱导的转录激活（RITA）复合体也含有RHA和CTR9。saRNA可以缓解沉默肿瘤抑制基因（如p21）或其他典型失调基因（如E-cadherin）的下调，因此可能促进基于双链RNA的癌症和其他疾病治疗方法的发展。

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经CRISPR编辑引导的RNA

原核生物衍生的CRISPR相关蛋白（Cas）系统已广泛应用于哺乳动物细胞和生物体中精确编辑基因组序列，导致不可逆转的基因敲除。

从机制上讲，该系统依赖于导向RNA（gRNA）和RNA导向的Cas核酸酶。gRNA通过与Cas结合形成Cas-gRNA核糖核蛋白复合物。该复合体可识别原间隔相邻基序（PAM）元件和目标序列中的20个核苷酸序列。然后Cas核酸酶在特定的位点切割双链DNA或ssRNA，以进行高效的基因组编辑。

最初的成功促进了靶向和操纵核酸的新方法的发展，如化脓链球菌（RCas9）的Cas9靶RNA需要匹配的gRNA和补充的PAM呈现寡核苷酸（PAMmer）。

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RNA适配体

适配体是具有明确三维结构的单链寡核苷酸，可特异性结合并抑制蛋白质。

适配体通过指数富集的配体系统进化（SELEX）用于适体选择。

基于适配体的疗法包括：（1）拮抗适配体破坏疾病相关靶点之间的相互作用，如蛋白质-蛋白质或受体-配体相互作用。目前临床试验中的所有适体都使用这种策略（图3 D①）；（2）细胞类型特异性适体用作载体，将其他治疗剂输送到靶细胞或组织（图3 D②）。

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mRNA

mRNA编码药物的概念是在20世纪90年代发现的，当时将IVT mRNA直接注射到小鼠骨骼肌中，显示编码蛋白表达。

IVT mRNA的临床前研究促进了基于mRNA的癌症和传染病疫苗的临床发展。从机制上讲，注射的mRNA疫苗被递送到宿主细胞（通常是抗原呈递细胞，APCs）的细胞质中，并被翻译成靶向抗原。随后，主要组织相容性复合体（MHCs）将表达的抗原呈递到APCs表面，激活B细胞/抗体介导的体液免疫和CD4+T/CD8+细胞毒T细胞介导的免疫。此外，注射编码免疫刺激因子，如细胞因子、趋化因子的mRNA可促进APC的成熟和激活，从而诱导t细胞介导的应答，改善免疫肿瘤微环境。

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RNA药物面临的挑战与解决方案

通过克服细胞外和细胞内的障碍，RNA递送到细胞质的效率仍然是RNA成功治疗关键挑战。因此，为了解决与药效学和药代动力学相关的挑战，人们探索了各种化学修饰和给药配方的工程。

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化学修饰
化学修饰是传递基于RNA的药物最有前途的策略之一。核酸骨架、核糖环和碱基本身的修饰已被广泛用于优化类药物特性以增强给药。

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图4 克服RNA疗法在发展中面临的挑战

● ASOs和siRNA

ASOs进入生物体后，会与细胞表面蛋白结合，通过内吞作用形成细胞内囊泡，进入细胞后，在蛋白的帮助下进入细胞核，其中为降低毒性和免疫原性，硫代磷（PS）骨架的修饰（图4 A①）是ASOs中最早和最常用的化学修饰。

PS骨架修饰可通过增强疏水性、抗磷酸二酯酶和与血清蛋白的紧密结合促进细胞吸收和体内生物利用度。2'糖在核糖上的修饰，包括2'-氟（F），2'-甲氧基乙基（MOE），2'-甲基（O-Me）或有o-亚甲基桥或锁定核酸（LNA）2'，4'-双环，来提高结合亲和力，提高碱基配对熔化温度（图4 A②）。

LNA及其甲基化衍生物现广泛应用于ASOs中，包括间隙子、剪接开关ASOs、siLNA和抗基因ASOs。

2'-F和2'-O-Me修饰模仿2'-OH的生物物理特征，可以稳定siRNA对抗RNA酶，同时也可以阻止siRNA激活先天免疫受体（TLR、MDA-5和RIGI）。因此，临床试验中的所有治疗性siRNA都有2'-F或2'o-me修饰。

● mRNA、CRISPR-Cas引导的RNA和适配体

从IVT mRNA结构来看，其是一种含有5′帽结构的ssRNA，一个开放阅读框，侧翼5′和3′UTR和3′poly（a）尾巴。

mRNA疫苗的优化往往从就是从5'端入手，通过序列优化、核苷修饰或utr序列替换来增强RNA的翻译能力。各种化学修饰核苷，包括假尿嘧啶，n1-甲基假尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶和2-硫脲嘧啶等结构被引入到mRNA中，以减少IVTmRNA触发的先天免疫反应。

CRISPR系统在治疗使用中存在许多障碍，包括有效的递送、可检测的脱靶效应、潜在的免疫原性等。

与ASOs和siRNA一样，多用途的化学修饰和结合可以增强RNA适体的药代动力学特征，其中，用于ASOs和siRNA的化学修饰模式同样可应用于gRNA和Cas9mRNA。临床试验中的大多数适体采用5'端聚乙二醇（PEG）修饰来用于抵抗肾脏清除，以及3'端倒置胸苷激酶修饰策略和糖环上的2'-取代进行化学修饰用于防止核酸酶降解，除此之外，PS连锁修饰还可以通过提高目标结合亲和力来优化适体的性能。

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递送载体的择选至关重要

由于RNA具有大量的负电荷和化学修饰，因此有必要开发一种有效的载体来保护所携带的RNA免受有害的生理环境的伤害。纳米技术和材料科学的进步为寡核苷酸药物传递的挑战提供了优势和潜在的解决方案，特别是对跨越生物屏障和膜的细胞内传递的要求。

● 脂质纳米粒（LNP）

LNP是应用最广泛的寡核苷酸药物载体。LNPs由可电离的阳离子脂类、胆固醇、磷脂和聚乙二醇脂类组成（图4 B①），可电离阳离子脂类是其核心成分。

以LNP介导的siRNA递送为例（图4 B），酸解离常数（pKa）决定了纳米粒子的电离行为和表面电荷，从而影响递送过程。首先，带正电荷的LNPs通过包裹RNA来阻止阴离子RNA进入核酸酶，并通过受体介导的内吞作用帮助RNA穿越细胞膜，进入细胞后，纳米粒子上的电荷增加。pKa在这个范围内的纳米颗粒被质子化并产生缓冲能力，这会导致渗透肿胀和核内体破裂。然后，siRNA从核内体逃逸到胞浆中，这是其传递的关键限速步骤。

因此，siRNAs通过与RISC相关联来切割目标RNA，优化LNPs的pKa可以显著提高RNA药物的传递效率。此外，利用新兴的先进技术，装载LNP的RNA实体可以安全有效地传递到特定的细胞、器官和组织。

● 阳离子聚合物

多聚物是用于RNA输送的标准配方，它们是由阳离子聚合物和带负电荷的核酸之间的静电相互作用自发形成的（图4 B②）。

聚乙烯亚胺（PEI）聚合物家族是研究最广泛的核酸传递聚合物材料，可与miRNA或siRNA形成纳米级复合体，从而实现RNA保护和细胞传递。此外，PEI功能与氧化石墨烯水凝胶原位转化RNA疫苗已被有效用于癌症免疫治疗。然而，PEI具有相对的细胞毒性，且不可降解。

壳聚糖是一种存在于甲壳类动物外骨骼中的生物聚合物。由于壳聚糖的生物降解性、生物相容性和渗透性增强特性，现在壳聚糖及其变体已被开发用于DNA和siRNA的传递。然而，低转染效率限制了其临床应用。

目前，还没有批准用于RNA传递的多聚物纳米颗粒。因此，现阶段还需要改进相应的策略，以生产可扩展的阳离子聚合物为基础的多聚物，具有高的靶特异性和较低的毒性或免疫原性。

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发展新方法成为必然趋势

● 外泌体

外泌体是脂质膜包裹的囊泡（图4 B③），影响许多细胞生物学过程的重要细胞间通讯介质，它们可以运输生物活性成分并克服血脑屏障。因此，外泌体作为治疗药物的潜在运载载体引起了广泛关注，其中工程外泌体可以以最小程度的免疫清除率与不良反应传递不同的RNA种类。

● 球形核酸（SNAs）

SNA在外层是密集排列的放射状核酸，并可以与无机纳米颗粒核共价结合，其中金纳米颗粒是最常用的SNA核。

SNAs能够有效地传递核酸，主要是因为，其三维结构可以被A类清道夫受体识别，同时也具有快速的细胞吸收动力学和细胞内运输。其次，SNAs表面的高密度核酸抑制核酸酶介导的降解。因此，在不使用转染剂的情况下，它们几乎可以进入任何细胞类型和各种皮肤、肿瘤和血脑屏障。

通过外泌体传递SNAs、修饰寡核苷酸糖骨架或修饰纳米颗粒聚乙二醇化可进一步增强SNAs的有效性。

● DNA纳米结构

基于DNA的纳米结构也被广泛用作运载工具（图4 B⑤）。

DNA的自组装特性允许这种纳米结构通过序列互补结构域杂交折叠成用户定义的形状。因此，可以在纳米尺度上精确控制物体的尺寸，并对物体的形状和塑性进行微调，最终通过在结构表面结合ASOs或siRNA来传递RNA。然而，DNA纳米结构的高成本和自组装的高错误率限制了其在复杂结构中的应用。

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基因技术在医疗领域应用

基于RNA的治疗方法首次被用于有明确理由的疾病，如肿瘤学、神经系统疾病和传染病。此外，其他药物目前正在进行临床前或临床试验，更先进的基于RNA的治疗方法也即将被开发出来。

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ASOs在临床试验中的表现
ASO药物正在为迄今为止没有治疗选择的患者产生重大治疗益处，ASO的作用自1978年被发现之后，其研究不断进步，目前成为核酸药物的重要领域之一。

随着我们对ASO药物认识的提高，还有机会进一步提高ASOs的安全性和耐受性。例如，一些PS修饰的ASO降低血小板计数的机制值得进一步研究，从而设计出更安全的药物。此外，还有机会进一步改善患者用药的便利性，如注射/递送装置和口服制剂。

在对基于ASOs的疗法进行的100个I期试验中，在过去5年有一部分研究进入了治疗罕见和常见疾病领域，如孤儿基因改变和癌症。

Fomivirsen是FDA批准的第一代治疗艾滋病患者巨细胞病毒视网膜炎（CMV）的ASO药物。这种PSASO与人CMV即刻早期mRNA互补，可抑制病毒蛋白质合成并中断病毒复制。

自2002年Fomivirsen从欧洲和美国市场退出，Mipomersen和inotersen成为第二代ASO药物，称为Gapmers或嵌合ASOs。

Eteplirsen是另一种用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）患者的剪接调节寡核苷酸。除此之外，golodirsen、viltolarsen和casimersen已被批准用于治疗具有特定剪接缺陷的DMD。这四种药物与依替普利森一起属于第三代ASO药物，属于PMOs复杂的化学修饰。

ASO药物研发龙头企业已经搭建起成熟的药物开发平台，形成了丰富的研发管线且所开发的适应症范围也在不断拓展。目前，ASO药物开发的工作重点主要集中于稳定性化学修饰，以增强体外和体内除肝脏外的组织的效力和活性，进一步拓展治疗窗口。

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RNAi、CRISPR/Cas基因编辑与适配体疗法
Patisiran和galnac共轭siRNA。迄今为止，三种siRNA药物已被FDA批准，而7种siRNA候选药物正在进行III期临床试验。

Patisiran是FDA批准的第一种用于治疗hhtr伴多神经病变的RNAi基药物，开启了RNAi疗法蓬勃发展的新时代。此外，Alnylam开发了稳定化学galnac给药平台，以提高siRNA药物的临床疗效。到目前为止，临床试验中大约三分之一的RNAi药物是galnac结合的siRNA。

其中，Revusiran是第一种能够显著增加唾液糖蛋白受体在肝脏传递过程中的吸收的GalNAc siRNA药物。不幸的是，由于在”ENDEAVOUR”III期临床试验（NCT02319005）中死亡率不平衡，该药物被终止。

尽管Revusiran失败了，Alnylam仍继续开发GalNAc siRNA结合物用于治疗，通过在siRNA中定位化学修饰，可对核酸酶活性提供额外的稳定性。

RNAi疗法现已从肝脏扩展到其他器官，针对各种疾病，从影响更大患者群体的罕见疾病到常见疾病。例如，夸克制药公司已经开发了治疗肾损伤和眼病的药物。目前，制药行业的重点已经迅速转向用于癌症治疗的RNAi药物。

除RNAi疗法，首次应用CRISPR/Cas基因编辑的人体临床试验，是使用体外Cas9敲除自体T细胞中的PD-1，现阶段，也将CRISPR/Cas应用于β-地中海贫血遗传疾病、视网膜缺陷的人体等试验中。

在核酸适配体中，Pegaptanib（Macugen）是fda批准的第一种靶向VEGF的适体药物，用于治疗老年性黄斑变性。许多其他适体正处于临床前或临床开发阶段，用于可能的疾病治疗，如视力障碍、凝血、肿瘤和炎症。

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mRNA疫苗
与研发相对缓慢和费力的传统疫苗相比，基于mRNA的疫苗具有快速设计和快速规模化扩增的特点，同时具有高效力和低成本的优点。新冠疫情催生下的mRNA技术难点的加速突破及商业化落地，使mRNA疫苗成为可预期的未来。

先进的mRNA疗法应用在预防传染病疫苗方面。到目前为止，包括流感、寨卡病毒和呼吸道合胞病毒在内的各种传染病的mRNA疫苗已经开发出来。在持续的新冠疫情大流行期间，基于mRNA的疫苗已被证明对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）有效。

例如，辉瑞/BioNTech的BNT162b2、Moderna的mRNA-1273，现都已被FDA批准。

近年来，基于mRNA的癌症疫苗的应用得到了评述。从2017年7月Nature首次报道两项肿瘤新抗原疫苗临床试验进展开始，肿瘤疫苗经历了单药可于外周血检测到抗原特异性免疫T细胞、可于肿瘤组织内检测到特异性免疫T细胞浸润及功能性杀伤、与PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂联用显示协同疗效、再到与化疗等多种肿瘤治疗方案多组联用增效，适应症也从黑色素瘤逐步扩展到胶质母细胞瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌等，临床应用前景逐步明朗。

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RNA疗法的最新进展

除了miRNA拮抗剂和miRNA模拟剂外，人工环状RNA海绵（circRNA）是很有前途的治疗性环状RNA是ncRNA的一个子类，它们抗核酸酶降解，比线性RNA更稳定。

最近的研究结果表明，在小鼠模型中，工程circRNA是miR-132和−212的有效海绵，可以减轻压力过载诱导的体内肥大。在抑制miRNA功能方面，这些circRNA也显示出比目前的“金标准”拮抗SIR有更强的体外疗效。此外，针对SARS-CoV-2和新出现的变种的circRNA疫苗引发了更高和更持久的免疫反应。事实上，越来越多的研究都集中在非编码RNA疗法上，并有着火热讨论。

再以Cas13d介导基因组治疗的研究进展为例，其已被证明可以有效地下调体外哺乳动物细胞中的细胞RNA。CasRx系统衍生的方法比RNA介导的基因敲除更特异性和效率。因此，casrx介导的治疗提供了一种强大的方法来沉默肝细胞和体内其他细胞中的基因。最近，这种疗法还被提议用于治疗RNA类病毒感染，如SARS-Cov-2。

参考文献：
1.Bennett CF. Therapeutic Antisense Oligonucleotides Are Coming of Age. Annu Rev Med. 2019 Jan 27; 70: 307-321.

2.RNA-based therapeutics: an overview and prospectus；Nature

3.差异化才是突破之道 | 对话新合生物潘有东：如何抓住mRNA肿瘤疫苗机遇？；同写意

4.Nature Reviews｜RNA疗法的创新发展和新兴技术；医药学术