背景

流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道感染，在全球范围内传播。流感病毒分为甲、乙、丙、丁四型。甲型和乙型流感病毒可传播并引起季节性流行性疾病。虽然流感已被 COVID-19 大流行掩盖，但它仍然是全球健康的主要威胁，可在高危人群中造成严重疾病和死亡[1]。

预防流感最有效的方法是接种疫苗。目前减毒活病毒疫苗面临免疫原性欠佳、安全性低、制造工艺技术繁琐等问题。近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所司龙龙课题组开发了一种使用蛋白水解靶向嵌合 (PROTAC) 技术，通过宿主细胞的内源性泛素-蛋白酶体系统降解病毒蛋白的减毒活A型流感病毒疫苗，相关工作发表在Nature Biotechnology上[2]。

作者 | 七月

PROTAC是一种双功能分子，通过将目标蛋白质靶向泛素-蛋白酶体系统来诱导其降解。它们通常包含两个共价连接的部分，一个对感兴趣的蛋白质具有特异性，另一个对 E3 连接酶具有特异性。靶向蛋白质降解技术主要在抗肿瘤领域研究较多，近年来，其作为一种抗病毒方法也越来越受到研究者们关注。

PROTAC病毒生产系统概述

鉴于病毒复制依赖于病毒编码的蛋白质，司龙龙课题组认为通过使用宿主细胞的蛋白质降解机制来操纵病毒蛋白质的稳定性可能代表一种打开和关闭病毒生命周期以进行疫苗开发的潜在方法。在该研究中，研究者们在甲型流感病毒基质蛋白基因片段上设计了一个可条件性敲除的蛋白酶体靶向结构域（proteasome-targeting domain，PTD）。该PTD包含ALAPYIP肽段，能够识别von Hippel–Lindau（VHL）肿瘤抑制蛋白，而VHL正是CRL2VHL E3泛素连接酶的底物识别成分。VHL在大多数正常组织和细胞类型中的普遍表达可以为 PROTAC 疫苗的安全性提供关键基础。

PROTAC病毒通过蛋白酶体介导泛素化病毒蛋白 (M1-PTD) 的靶向降解而减毒，导致蛋白质合成不足和病毒复制减弱。而未与PTD融合的病毒核蛋白（NP）则不会被降解。在疫苗生产过程中不应减弱病毒复制，因此PTD也包含烟草蚀刻病毒切割位点（TEVcs）接头ENLYFQG，该接头可被烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEVp）选择性切割，从而避免病毒蛋白在稳定表达TEV蛋白酶的细胞中降解。（图1）

PROTAC病毒作为潜在疫苗的安全性在很大程度上取决于它们在常规细胞中的减毒程度。为了量化病毒蛋白M1-PTD的衰减情况，研究者们以0.01的感染复数（MOI）测量了 M1-PTD 和 WT 病毒在 MDCK-TEVp 和 MDCK.2 细胞中的复制动力学。结果显示M1-PTD仅在 MDCK-TEVp 细胞中而不在 MDCK.2 细胞中表现出有效复制（图2）。

接着，研究者们通过在存在和不存在蛋白酶体抑制剂MG-132的情况下在常规 MDCK.2 细胞中扩增 M1-PTD病毒，以证明来PTD 介导的病毒蛋白降解和PROTAC 病毒的减毒是蛋白酶体依赖性的。

此外，研究者们在小鼠和雪貂的动物模型中也评价了PROTAC 病毒的减毒作用。结果显示，WT病毒在小鼠体内的中位致死剂量（LD50）为104PFU，10×LD50的WT病毒导致所有小鼠死亡，并伴有明显的体重减轻。相反，在相同剂量的 M1-PTD 感染小鼠中未观察到死亡、体重减轻或其他指示性临床症状（图3a，b）。在雪貂模型研究中，研究者们进一步证实了M1-PTD 的安全性。接种后第3天，与WT病毒相比，雪貂鼻腔冲洗液、气管和肺中的 M1-PTD 滴度分别显示约-log2.0、约-log2.1和约-log2.9（图3c，d）。来自动物模型的所有数据表明，流感病毒在体内通过使用宿主蛋白质降解机制大大减毒。

同时，也有数据表明PROTAC 疫苗在小鼠和雪貂中能够诱导强大而广泛的免疫反应。M1-PTD （105 PFU）引发的针对病毒表面HA蛋白和内部保守核蛋白（NP）的 HI 抗体、NT抗体和免疫球蛋白G（IgG）的滴度显着高于（5-50倍）由目前最广泛使用的灭活流感疫苗（IIV）引起的免疫反应。

总结与展望

理想的疫苗应在宿主中充分减毒以确保安全，同时保持强大的免疫原性以确保疗效，并能够在适合制造的组织培养平台中高效生产。司龙龙课题组通过使用宿主的蛋白质降解机制来控制病毒蛋白质的稳定性，成功地开发了PROTAC 病毒疫苗。PROTAC病毒可以在常规细胞中高度减毒，但可以保留在工程化的表达 TEVp -MDCK细胞系中保留高效复制能力，该细胞系已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于人类疫苗生产[4]。PROTAC病毒可以在体内充分减毒，但仍可以引发强大而多样的体液、粘膜和细胞免疫，因此可以提供针对同源和异源病毒攻击的广泛保护。

除了临床上使用的生产灭活疫苗（IIV）和减毒疫苗（CAIV）的方法外，在临床前研究中还开发了几种其他策略来减毒病毒。与这些现有方法相比，PROTAC病毒疫苗技术采用了独特的疫苗设计原则——即有条件地将病毒蛋白靶向宿主的蛋白质降解系统，以产生蛋白水解靶向病毒作为疫苗。该方法有五个关键特征：

（1）PROTAC病毒疫苗可以将病毒高度减弱到低水平的复制能力，可能比现有方法产生的安全性更高。

（2）PROTAC病毒疫苗可能能够减弱多种季节性或大流行病毒株，在疫苗和目标病毒之间提供足够的抗原匹配，从而增强效力。

（3）因为在人类泛素-蛋白酶体系统中发现了600多种E3连接酶，因此理论上许多PTD可用于生成PROTAC病毒。

（4）PROTAC病毒疫苗是一种简单而通用的方法，可能适用于许多其他病毒，并且大多数实验室都可以使用。

（5）通过使用表达 TEVp 的细胞或表达兴趣的病毒蛋白，它可以在正常细胞培养条件下的数周内实现具有成本效益的疫苗生产。

最后，PROTAC 疫苗的潜在安全问题还需要进一步研究。由于VHL是一种肿瘤抑制蛋白，并且在透明细胞肾癌中发现VHL丢失，这一结果也引起了人们对使用VHL作为PROTAC靶标的担忧。正如司龙龙等研究者们所指出的，PROTAC方法或特定PROTAC病毒可能不适合某些人：如接受蛋白酶体抑制剂治疗的人或特定E3连接酶表达有缺陷的人。然而，也可以研究许多不同的PTD-E3连接酶对和PTD-病毒蛋白接头。尽管从一套 E3 连接酶中进行个性化选择对于基于人群的疫苗生产是不可行的，但仍有开发安全、有效和具有成本效益的改进PROTAC候选疫苗的空间。随着该方法扩展到其他病毒病原体，选择最佳病毒蛋白作为目标并确保有效切割是需要研究的细节之一。

参考文献：
[1] https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)
[2] Si, L., et al. Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting. Nat. Biotechnol. (2022).
[3] Brad Gilbertson, Kanta Subbarao. A new route to vaccines using PROTACs. Nat. Biotechnol. (2022).
[4] Ping, J., et al. Development of high- yield influenza B virus vaccine viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, E8296–E8305 (2016).
封面图：http://k.sina.com.cn/article_2010666107_v77d8547b02000zjml.html?display=0&retcode=0