CAR-T细胞疗法在血液瘤的治疗中取得了革命性的成功，但不可控性是其一大风险。CAR-T细胞不受控地增殖可能会触发细胞因子释放综合征（CRS），这种炎症因子在体内的释放会导致从轻度发烧到危及生命的器官衰竭等多种毒性。此外，对于实体瘤，分子复杂性、良好抗原靶点缺乏、肿瘤微环境中的免疫抑制等使得CAR-T效果大打折扣，这很大程度上限制了其应用。而“CAR-T开关”为解决这些问题提供了出路。

在细胞治疗领域，开关控制的平台设计已经有太多的研究，包括控制激活的通路，发挥杀灭肿瘤的作用；也包括抑制通路的，比如自杀激活，为了防止不可控的态势及时踩刹车；同时还有通过调控活细胞内部的共刺激通路，实现对细胞治疗的调控等等。这里，我们盘点了近年来一些有趣的代表性CAR-T开关设计。

光热开关

2021年8月12日，来自佐治亚理工学院的研究人员在Nature Biomedical Engineering上发表文章报道，他们开发了一种新型的“光热开关”CAR-T细胞治疗，以应对实体瘤限制CAR-T疗效的挑战。

具体来说，研究人员为CAR-T细胞增加一个光热敏感开关，使得这些CAR-T细胞在40–42℃时能够触发CAR的表达。体外研究显示，通过加热15–30分钟后，这些T细胞的转基因表达超过60倍，而不影响细胞增殖、迁移和细胞毒性。

在小鼠模型实验中，全身递送的CAR-T细胞在通过植入肿瘤的金纳米棒光热控制下，还能在肿瘤内产生IL-15超抗原分子或携带NKG2D受体的双特异性T细胞衔接器（可重定向T细胞对抗NKG2D配体），从而增强抗肿瘤活性并减轻抗原逃逸。

该研究的通讯作者Gave Kwong表示：“IL-15超激动剂等这些抗癌蛋白确实能够刺激CAR-T细胞，但是它们的毒性太大，不能在肿瘤之外使用，也就无法全身递送，但是通过我们的方法可以安全的定位这些蛋白的作用位置。”

研究人员还表示，该研究的缺点之一是激光不能很深入地穿透身体。如果将来用于人体临床，将会使用聚焦超声波进行光热激活CAR-T，这样可以无创地瞄准身体的任何部位。

“超能力”开关 

提到超声波，同一日，美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员也在Nature Biomedical Engineering上发表文章证明，将超声波与CAR-T细胞疗法相结合，可以在保护正常组织的同时摧毁恶性肿瘤。该疗法显著减缓了小鼠实体瘤的生长。

具体来说，研究人员将重新设计的CAR-T细胞注射到小鼠的肿瘤中，然后在肿瘤顶部的皮肤区域放置一个小型超声换能器以激活CAR-T细胞。换能器使用所谓的聚焦超声束将短脉冲超声能量聚焦在肿瘤处。在这种情况下，肿瘤会适度升温，达到43℃，但不会影响周围组织。而新设计的CAR-T细胞配备了一种基因，这种基因只有在受热时才会产生CAR蛋白。因此，这种CAR-T细胞只在应用超声波的地方启动。

对比试验显示该方法安全有效。并且，因为超声波可以穿透皮肤下几十厘米的地方，因此这种疗法有可能非侵入性治疗埋在身体深处的肿瘤。

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“饥饿疗法”开关

2020年7月13日，剑桥大学的James Patterson博士和斯坦福大学的研究小组在NatureBiotechnology上发表文章报道，他们使用一种称为营养缺陷型的方法来解决CAR-T的毒性作用。即对细胞进行基因改造，使其依赖特定的营养物质，然后通过提供或清除这类营养物质来使细胞存活或死亡。这种方法避免了普遍的插入开关需要将新的遗传物质引入细胞所带来的免疫原性和转基因沉默问题。

具体来说，研究团队敲除了T细胞和干细胞中的尿苷单磷酸合成酶（UMPS）基因，这使细胞的增殖依赖于外部尿苷，在体外和体内的异种移植模型中都能通过调节尿苷供应来控制细胞生长。

Patterson根据这种方法创立了Auxolytic，致力于针对各种类型细胞的新型安全“关闭”开关的开发。公司希望通过敲除特定的酶基因使细胞依赖特定营养素而得以生存，而在实践中，患者会服用特定营养素来启动细胞的活性，如果观察到严重的副作用，则可通过中断营养供应使体内的治疗性细胞被清除，从而减少或停止副作用。

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抗原密度敏感型开关 

2021年3月12日，美国加州大学旧金山分校与芬兰赫尔辛基大学的研究人员合作在Science上报道了他们的研究成果。他们设计了一个两步正反馈电路，即给CAR-T细胞加了一个开关，可让其根据S型曲线抗原密度阈值来区分靶标，从而避免CAR-T细胞对表达低水平肿瘤抗原的正常细胞误杀，也为攻克实体瘤提供了一个关键性工具。

在该电路设计中，研究人员利用一种名为synNotch的受体来检测HER2抗原表达。低亲和力synNotch受体作为一个过滤器，限制转录诱导只发生于T细胞遇到高抗原表达靶细胞时。而一旦通过这个初始过滤器，诱导的高亲和力CAR就能进行强效的T细胞增殖和杀伤。

由于在实体瘤中，肿瘤特异性抗原（TSA）很少，目前发现的肿瘤高表达的抗原更多的是肿瘤相关抗原（TAA），TAA抗原在正常组织中一般也有少量表达，用传统的CAR-T细胞治疗时就会产生较大的毒性，限制了CAR-T细胞的使用。该研究通过synNotch-CAR low-high circuit设计可以让这种CAR-T细胞只在高抗原密度的肿瘤细胞部位才会表达CAR分子，进而杀伤肿瘤细胞，而对低抗原密度的健康细胞没有杀伤，降低了CAR-T细胞的毒副作用，因此可以选择更多的TAA作为CAR-T细胞治疗的靶点，拓展了CAR-T细胞治疗的应用范围。

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小分子化合物开关 

为了解决CAR-T细胞疗法毒性问题，科学家们为CAR-T细胞设计了一些快速且可逆的“ON”或“OFF”键，也就是使用小分子作为安全开关。这些小分子包括白藜芦醇、来那度胺、达沙替尼、rimiducid、雷帕霉素等。

2021年8月17日，华东师范大学叶海峰教授团队在PNAS上发文报道，他们构建了一种白藜芦醇调控转基因表达的转录调控系统（ON/OFF），通过白藜芦醇调控 T 细胞中 CAR 的表达（ON）与抑制（OFF），从而实现可控的 CAR-T 细胞免疫治疗。

简单来说，研究小组以白藜芦醇作为开关分子设计了两种 CAR-T 细胞，分别包含可以控制CAR-T 细胞失活和激活的基因线路，对应两种不同的应用场景。当 CAR-T 细胞在体内过度激活而产生细胞因子风暴等副作用时，白藜芦醇可启动让细胞失活的基因线路将其沉默；反之，可以先注射失活的 CAR-T 细胞，再通过白藜芦醇进行浓度依赖性的激活。

2021年1月6日，Dana-Farber癌症研究所和麻省总医院癌症中心的研究人员在Science Translational Medicine发文报道，利用一种常用的癌症药物来那度胺，可以实现CAR-T细胞的开启或关闭。使用来那度胺可以使具有OFF开关的T细胞失活，而具有ON开关的T细胞则需要同时使用来那度胺和靶抗原才能激活，从而可以控制T细胞激活的时间。

研究人员使用靶向蛋白降解技术来创建CAR-T细胞的开关系统。在细胞中，E3（泛素）连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白贴在靶蛋白上将其标记为缺陷或受损蛋白。之后，细胞内的蛋白酶体会降解被标记的靶蛋白。来那度胺就是借助了这一机制来发挥作用。这类药物可重定向E3泛素连接酶CRL4CRBN，从而使转录因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，导致IKZF1和IKZF3被蛋白酶体降解。

在OFF开关中，研究人员设计了降解标签，并且系统筛选确定了对来那度胺诱导的降解敏感性增强的"超级降解"标签，当这种降解标签贴在CAR上时，来那度胺（或另一种沙利度胺类似物）将诱导贴上降解标签的CAR的泛素化和蛋白酶体降解，从而阻止T细胞继续识别癌细胞。

由于这些工程化的T细胞会持续制造CAR蛋白，在来那度胺治疗后，新的CAR蛋白会不断积累，T细胞的抗肿瘤功能会得到恢复；在ON开关结构中，研究人员设计了一个来那度胺诱导的二聚体系统，开发了需要来那度胺和靶抗原同时激活的CAR。

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2019年7月3日，美国纪念斯隆·凯特琳癌症中心和德国维尔茨堡大学医院的研究人员发表在Science Translational Medicine上的文章表明，百时美施贵宝的白血病药物达沙替尼（Sprycel ）可以在不破坏细胞的情况下暂时关闭CAR-T细胞的功能。在研究中，及时施用达沙替尼能将面临严重CRS的小鼠存活率从25%提高到70%。更重要的是，这种影响是可逆的，不会损害CAR-T细胞长期杀伤肿瘤的能力。

达沙替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以阻断CAR-T细胞活化的一个重要步骤，即磷酸化。具体来说，达沙替尼抑制了LCK、CD3和ZAP70的磷酸化，导致NFAT的诱导受限-NFAT是激活CAR-T细胞中的关键转录因子，从而将这两种CAR-T细胞锁定在非活性状态，阻止它们产生引起CRS的炎症分子。

另外，达沙替尼的抑制作用对于含有CD28/CD3与4-1BB/CD3信号结构域的CAR构建体同样有效，并确定40nM的达沙替尼为基准剂量，在该剂量下，每种CAR构建体完成了对CAR-T细胞功能的完全抑制。这一作用机制表明，达沙替尼作为一种功能开关，广泛适用于使用该信号传导机制的CAR构建体。

2019年3月，Bellicum公司研究人员发表在Molecular therapy. Oncolytics上的一篇文章初步证实了他们开发的一种“双安全开关”的CAR-T细胞可以以药物依赖性方式促进CAR-T细胞扩增并且延长持久性，同时提供了安全开关以减轻毒性。

简单来说，为了提高CAR-T细胞功效，该研究团队使用了基于rimiducid的诱导型MyD88和CD40（iMC）信号元件的强效激活开关。而为了消除这种增强的CAR的潜在毒性风险，他们开发了正交调节的雷帕霉素诱导的基于caspase-9的安全开关（iRC9）以允许在体内消除CAR-T细胞。

Rimiducid诱导的iMC共刺激增强了CAR-T细胞增殖、细胞因子分泌和体外抗肿瘤效力。而雷帕霉素介导的iRC9二聚化以剂量依赖性方式快速诱导细胞凋亡，可减轻治疗相关毒性。

以上即为一些代表性的小分子化合物开关。值得注意的是，用作开关的小分子化合物需要有明确的药效和药代特性，并且可以通过人工操作“ON”或“OFF”来控制CAR-T细胞的功能。此外，小分子应足够安全，最好是低免疫原性。小分子还应通过药物定向运输技术来选择性的运送到靶组织，从而进一步减缓脱靶毒性。

目前，大部分小分子安全开关尚未在CAR-T的临床研究中得以检测，其增强CAR-T安全性的效果仍需拭目以待。

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除了上述提到的，当然还有许多有意思的CAR-T开关设计。例如，Scripps研究所的Haiyong Peng 团队开发了两种基于化学编程的抗体片段(cp-Fab) 为开关的新型 CAR-T治疗平台（cp-Fab/CAR-T）。第一种cp-Fab的Fab轻链或重链末端融合表达GCN4多肽片段（CAR-T识别的抗原），然后偶联叶酸分子（结合卵巢癌细胞高表达的叶酸受体）；第二种cp-Fab将叶酸小分子与GCN4多肽结合后再偶联到Fab上来调控CAR-T细胞的活性。CAR-T与cp-Fab分别管理能有效达到时断时续的开关效果，从而有效和特异性根除表达叶酸受体的癌细胞。

CAR-T开关的研究进展大大拓宽了CAR-T疗法的应用前景。目前，已有多家公司加入CAR-T开关的开发设计中。像Bellicum Pharmaceuticals、Precigen、Poseida Therapeutics和AutolusTherapeutics等公司的管线主攻小分子或工程蛋白诱导的CAR-T“自杀“途径。BioAtla则专注CAR-T的条件激活，所开发的CAB（Conditionally Active Biologics）技术基于肿瘤微环境参数作为启动CAR-T的开关。ImmPACT基于逻辑门的CAR-T平台解决了癌症治疗中的关键生物学挑战，如抗原逃逸、脱靶毒性和免疫抑制肿瘤微环境。

参考资料：
1# Ian C. Miller et al. Enhanced intratumoural activity of CAR T cells engineered to produce immunomodulators under photothermalcontrol. Nature Biomedical Engineering. 2021
2# KatrinMestermann et al. The tyrosine kinase inhibitor dasatinib acts as apharmacologic on/off switch for CAR T cells. Science Translational Medicine. 2019
3# Duong, MyLinh T et al. Two-Dimensional Regulation of CAR-T Cell Therapy with Orthogonal Switches. Moleculartherapy. Oncolytics. 2019.