全世界有超过2.5亿的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者，鉴于慢性乙型肝炎患者之间存在很大的异质性，目前尚缺乏有效的、安全的可实现功能性治愈慢乙肝的联合疗法。

为了实现这一目标，Spring Bank Pharmaceuticals 公司研究人员设计了一款可靶向所有HBV病毒转录物的新型嵌合反义寡核苷酸（CASOs），是通过将免疫调节剂二核苷酸SB9000（Inarigivir 的活性代谢物，Inarigivir 是一种口服的肝选择性RIG-I激动剂，目前正在慢乙肝患者中进行全球Phase II期临床试验。）跟可切割的连接体与反义寡核苷酸(ASO)进行链接而成。

研究假设，这种将基因沉默和免疫调节相结合生成的嵌合反义寡核苷酸（CASOs）双管齐下的方法可同时抑制 HBV DNA，RNA 和抗原产生，并在体内激活RIG-I，从而在慢乙肝患者中实现由免疫介导的病毒清除。

研究人员（a）使用标准的亚磷酰胺化学方法合成了一系列具有糖基和碱基修饰，并且是可针对 HBx RNA 不同区域的含有 8 至 20 个硫代磷酸酯的链接或没有链接SB 9000的反义寡核苷酸(ASO)。

（b）为筛选荧光素酶报道基因，研究人员将HBx基因克隆到海肾和萤火虫荧光素酶psiCHECK?-2双重载体（Promega）中。将反义寡核苷酸(ASO)与质粒一起转染到Hepa 1-6细胞中，并在24小时后测量荧光素酶活性。

（c）使用标准方案测试反义寡核苷酸(ASO)的血清稳定性和RNase H介导的互补RNA裂解。

抗HBV测定：（i）HepG2.2.15细胞：在脂质转染反义寡核苷酸(ASO)后，在HepG2.2.15 细胞中评估了反义寡核苷酸(ASO)的抗病毒活性。通过点印迹杂交（dot-blot hybridization）监测细胞外 HBV DNA 水平，并通过中性红色染料摄取评估毒性。

（ii）原代人肝细胞（PHH）：在第1天转染反义寡核苷酸(ASO)，并在第二天用HBV（基因型D，MOI 500）感染细胞。 感染后第11天收集培养上清液和细胞，以定量HBV DNA（qPCR）和 HBsAg，HBeAg（ELISA）。

研究结果

使用萤光素酶测定法鉴定出了有效的嵌合反义寡核苷酸（CASOs），在 0.--5 nM 时表现出大于 75％ 的敲低。 通常，嵌合反义寡核苷酸（CASOs） 的效力比不含 SB 9000 的相应反义寡核苷酸(ASO)效力高约10倍。与25％血清温育后，SB 9000 在6小时内从 CASO 上解离，所得的反义寡核苷酸(ASO)对核酸酶降解的抵抗能力长达48小时。

反义寡核苷酸(ASO)还显示出强大的 RNaseH 介导的互补RNA裂解。

在HepG2.2.15细胞中，两个先导嵌合反义寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 降低了 HBV DNA水平，EC50值在 10 至 99 nM 之间（CC50> 500 nM）。

此外，SB 527 和 SB 539 在 PHH 分析中仅以低纳摩尔 EC50 即可促使 HBV DNA 和病毒抗原（HBsAg和HBeAg）显著降低。 SB 527 和 SB 539 的目标 mRNA 区与HBV基因型A-H的同源性> 98％。

综上，研究发现这两款主要的嵌合反义寡核苷酸（CASOs） SB 527 和 SB 539 通过 RNase H 介导的机制敲低HBV病毒转录物，在基于细胞的测定中被发现是有效的抗HBV药物。 目前研究人员正在进行进一步的研究以开发主要的嵌合反义寡核苷酸（CASOs），从而寄希望能以联合疗法提高慢乙肝的功能性治愈率。（更多肝病新药研究信息敬请关注“肝脏时间”微信公众号）！

信息来源HepDART 2019大会论文集：Antisense oligonucleotides linked to the immunomodulatory dinucleotide SB 9000 are highly potent anti-HBV agents