2016年6月18日 讯 /生物谷BIOON/ --提及基因编辑技术，我们会立马想到这两年的明星技术—CRISPR/Cas9基因编辑系统，从某种意义上来讲，该技术就如何科学家们制造的新型小汽车一样，如今科学家们不仅仅是停留在制造这种“小汽车”的程度，而且科学家们已经开始开着小汽车开始兜风了。2012年底科学家们开始利用CRISPR/Cas9进行基因编辑，该技术可以沿着DNA在特殊位点进行切割，而需要借助较短的导向RNA来将Cas9核酸内切酶运输至特殊位点。

更有意思的是，目前很多研究团队已经在大规模的遗传筛查中开始这种技术，比如用该技术来鉴别驱动引发癌症对疗法产生耐药性的基因突变，或者快去评估药物靶点的作用，而在遗传筛查方面，RNA干扰技术远没有CRISPR/Cas9技术做得好，不管是在特异性还是效率上均是如此。

与此同时，MD安德森癌症研究中心的研究者Traver Hart等人就开始通过深入研究理解CRISPR/Cas9技术的能力及限制，如今CRISPR/Cas9工具箱一直在持续扩大，由博德研究所Zhang Feng及其它研究团队的研究者所进行的丧失活性的Cas9可以同基因组进行结合并停止或增强基因的转录；如今Zhang Feng等人正在对Cas9酶类进行工程化操作来使其更具特异性并且寻找新型的基因编辑蛋白。

CRISPR技术上的研究进展

研究者Zhang Feng此前讨论和如何对酿脓链球菌的Cas9蛋白进行工程化操作来改善其特异性，当DNA和导向RNA之间的配对并不完美时，Cas9核酸内切酶可以诱导脱靶突变，从而使其不能更加理想化在临床中进行精确的基因组编辑。

DNA链需要分离来适应Cas9蛋白，研究者Zhang Feng的结构性分析揭示了Cas9蛋白中的正电荷凹槽，而在该位点带负电荷的非目标DNA会与之相吻合，Zhang表示，如果可以中和其中一些正电荷，那么就可以减弱蛋白的稳定性从而使Cas9蛋白变得更加特殊。研究者针对Cas9创建了32个单点突变，并且通过可以进行验证但易错的的导向RNA将每个单点突变对基因EMX1进行靶向作用，Cas9中的5个突变可以对基因EMX1进行目标编辑但会降低10倍脱靶位点的切口；随后研究人员利用突变的Cas9对名为VEGFA基因进行切割，VEGFA基因可以被引导切割两个此前已经鉴别的脱靶位点。

尽管所有突变的Cas9都可以降低脱靶效应，但研究者表示，他们可以结合这些突变使Cas9变得更加具有特异性。Zhang Feng博士将这些特异性增强的Cas9蛋白称之为“eSpCas9突变体”，通过利用单点和三点突变的eSpCas9来检测多个导向RNAs时，科学家们就发现，这两种eSpCas9突变体都可以以相同的效率来对目标位点进行编辑，如今将多个突变的导向RNAs同野生型的Cas9进行结合，Zhang Feng博士的研究团队在可以提供特异性的导向RNA的3’端发现了所谓的“种子区”，相比较而言，这种新型的eSpCas9突变体就可以将 “种子区域”延伸至包括整个导向区域中，而且研究小组还将继续努力研究使得这种新型系统变得更加具有特殊性。

利用CRISPR来探索未知的基因功能

CRISPR系统最大的一个特点就是解析特异性导向RNA的作用机制，而这就可以帮助开发出在既定基因内部靶向作用每一个基因位点或多个位点的CRISPRs导向的慢病毒文库，随后就可以转换到细胞系中，从而就可以产生出单一基因既失活或被激活的细胞库。为了阐明这些筛查技术的潜能，研究者Zhang带领其研究团队开始开发抵御黑色素瘤的疗法，BRAF V600E是一种已知的癌症突变，而且美国FDA已经批准利用药物威罗菲尼（Zelboraf）来治疗此类突变的黑色素瘤，然而耐药性会在突变的细胞中快速产生，而且疗法24周后肿瘤就会复发。

Zhang开发的CRISPR敲除文库可以利用向导来靶向作用基因组中所有保守性的编码外显子，他表示，当设计出多种筛查实验时，我们总会利用多个向导以确保实验可以往下进行，同时任何一个向导的效率并不取决于脱靶修饰；随后研究者试图证实这些新型的候选者并且比较进行RNAi筛查的结果。如今研究者Zhang的实验室希望通过鉴别可以用作基因组编辑的酶类来更深入研究，来扩大CRISPR的基因编辑工具库，比如去年秋天他们发现了Cpf1，其作为另一种DNA内切酶，可以利用不同的切割活性装备，从而更加有效地应用于基因编辑中，此外研究小组还描述了另外一种CRISPR/Cas系统C2c1， C2c2 and C2c3，而且目前正在研究该新型系统的作用机制。

在人类细胞系中利用遗传筛查进行癌症靶向研究

基于RNAi的筛查技术可以在人类细胞中进行大尺度的微扰筛查，但对RNAi生物学机制的不完全理解以及筛查所产生的数据或许会产生一定的错误，刊登在Science上的一项研究报告中，来自MD安德森癌症研究中心的研究者Traver Hart对多种复杂的研究方法进行了论证来研究哺乳动物机体的基因功能。

此前在多伦多大学Jason Moffat的实验室进行研究时，研究者Hart就制定出了一套金标准，该标准可以被用于评估RNAi技术和CRISPR遗传筛查技术的质量；利用HCT116细胞系进行研究，研究者发现，CRISPR技术不仅非常敏感而且还不会产生额外的背景错误。

为何CRISPR技术会优于RNAi技术？CRISPR筛查技术可以在一系列具有生物学意义的基因表达水平上发挥作用，而shRNA（发夹RNA）似乎仅会在基因的高水平表达下发挥作用。近日Hart的研究团队开发了一种TKO文库（Toronto KnockOut library），该文库是一种可以靶向作用17661个人类编码蛋白基因的第二代慢病毒编码的导向RNA文库。研究人员在四种癌症细胞系及一种正常细胞系中进行了适当的筛查，研究者将适应性或必要的基因视为一种微扰可以降低细胞生长和增殖，同时研究者还检测到了将近1600个核心的适应性基因。

为了理解每种细胞系中特异性的弱点，研究者Hart减少了核心的要素并且进行了相关的功能性富集实验。癌细胞系中核心必要基因或许就可以被开发作为潜在的疗法靶点，2012年美国达纳法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)的研究人员就通过研究发现，当突变的癌症细胞剔除掉了编码肿瘤抑制基因的区域时，癌细胞就会去除多种“旅客”基因，而这些基因在癌症中并不扮演关键角色，但其或许会促进肿瘤细胞对特殊的损伤变得易感，这种概念就被称之为“并行致死”效应，而且研究者认为其或许可以帮助在临床上治疗疾病。

剔除肿瘤抑制基因区域附近的核心必要基因或许为开发新型疗法打开了一扇窗，比如POLR2A是一种可以编码RNA聚合酶亚单位的核心必要基因，在卵巢癌中，该基因的拷贝几乎总是与已知的肿瘤抑制基因TP53一起被剔除，而去年来自MD安德森癌症研究中心的研究者Xiongbin Lu就发现，TP53的缺失会使得结直肠癌细胞对聚合酶的抑制变得敏感。

核心必要基因的目录还会一直增加，随着更多研究人员进行大量关于CRISPR的筛查研究，而且这些研究会分散到基因组的各个位点中，同时随着异质性拷贝在肿瘤中的缺失，其中一种或许就会变为新型的疗法靶点；而这或将为癌症研究带来一定帮助和曙光。