在《2024财年GDUFA科学与研究报告》中，FDA利用内部资源和外部合作，在九大领域开展了超过70项研究课题，涵盖当前仿制药研发、审评以及监管科学的重大课题，旨在全面促进仿制药产品开发和可及。

如今我国的仿制药市场已不同以往，在质量和成本的双重压力下，我国仿制药企业纷纷迎头赶上，走在技术最前沿，同时也立足中美走向全球大市场。FDA的研究能够提供与一般指南不一样的独特角度，不仅提示开发方向，也可解决实际问题。

识林将逐一编译报告内容，包括代表性研究、课题目录以及已发布指南和文献清单，供我国仿制药企业查阅参考。

第一章：杂质

2024财年杂质课题研究：聚焦于亚硝胺

在GDUFA III期间，一个主要的GDUFA科学研究优先领域是开发用于仿制药的亚硝胺杂质控制方法。该领域的研究进展包括：i）了解药物中的成分如何可能促进或减少亚硝胺（例如，亚硝胺药物成分相关杂质（NDSRIs））等潜在有害杂质的形成；ii）评估人类接触这些杂质的风险；iii）开发用于简化新药申请（ANDA）申请人高效应对潜在风险的方法。

在2024财年，FDA关于药品中N-亚硝胺杂质的研究涉及两项外部研究资助和多个内部研究项目。这些工作集中于评估形成N-亚硝胺（包括NDSRIs）的风险，开发杂质定量分析方法，了解这些杂质的毒理学风险，探索通过重新处方药品（可能使用合适的抗氧化剂或pH调节剂）来预防或减少其形成的策略，并权衡重新处方对仿制药生物等效性（BE）的潜在影响。

药物中的成分如何可能促进或减少亚硝胺等潜在有害杂质的形成

药品中存在致突变性和致癌性N -亚硝胺杂质，可能带来潜在的安全风险。虽然在处方中加入抗氧化剂是一种潜在的风险缓解策略，但它们可能会通过抑制肠道药物转运蛋白来干扰被动肠道通透性和/或药物的主动转运。

外部研究资助（作为U18FD007054的一部分）与马里兰大学的合作目标是评估抗氧化剂对生物药剂分类系统（BCS）III类药物渗透性的影响，使用MDCK-II细胞单层进行研究。研究中包括的抗氧化剂有八种酸（抗坏血酸、阿魏酸、延胡索酸、咖啡酸、苹果酸、柠檬酸、4-氨基苯甲酸（PABA）和L-半胱氨酸）、丙基没食子酸酯和麦芽醇。研究评估了四种含有胺且形成NDSRIs风险较高的 BCS III类药物的抗氧化剂效果：盐酸雷尼替丁、西咪替丁、阿昔洛韦和吡仑西平。结果表明，至少可以将10毫克（或在某些情况下为25毫克）的测试抗氧化剂纳入药物处方，以潜在地阻止NDSRIs的形成，同时不影响低渗透性药物的被动肠道渗透性。另一项外部研究资助（U01FD005978）与卓越监管科学与创新中心（CERSIs）合作，这是加州大学旧金山分校（UCSF）、斯坦福大学和FDA的联合项目，专注于评估30种抗氧化剂对三种肠道转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和有机阴离子转运肽2B1（OATP2B1）的转运功能的潜在影响。在评估了两种最有效抗氧化剂的抑制效力和估计浓度后，研究结果表明，通常用于口服制剂的抗氧化剂不太可能在临床研究中阻碍肠道转运蛋白。

作为FDA内部研究项目的一部分，科学家们一直在开发使用液相色谱与高分辨率质谱联用（LC-HRMS）技术的NDSRIs分析方法。FDA开发的三种分析方法被纳入NDSRIs指导原则中。FDA的一篇出版物描述了NDSRIs分析方法的一个案例研究，探索建立分析程序生命周期的条件。此外，开发的方法还被应用于分析多种药品中的NDSRIs，为了解NDSRIs污染的程度提供了见解，这些发现为基于证据的监管决策提供了信息。最近的研究发现，NDSRIs污染也可能源自原料药（API）的有关物质（或片段）。FDA的科学家们分析了多种药品中的这一类NDSRIs及其API片段前体。其结果有助于估计API片段NDSRIs的发生情况以及从这些前体转化的可能性，从而为解决这一新兴挑战的监管策略开发提供了有价值的信息。

在另一个研究项目中，FDA 的科学家们研究了盐酸二甲双胍药品中N-亚硝基二甲胺（NDMA）形成的潜在机制。对形成NDMA的药品处方的比较表明，处方中羟丙甲纤维素辅料的含量与NDMA的形成之间可能存在相关性。这可能是由于羟丙甲纤维素中可能存在的亚硝化剂与用于合成盐酸二甲双胍API的残留二甲胺（DMA）发生反应。

FDA的科学家们还继续研究减少药品中亚硝胺形成的缓解策略。使用布美他尼作为第一个模型药物的初步缓解研究项目的成果已发表，并被引用在更新的FDA行业指南中，以推荐使用抗氧化剂和pH调节剂来减少药品中亚硝胺的形成。科学家们进一步研究了不同抗氧化剂和pH调节剂在片剂处方中的效果，以及不同的生产工艺条件以减少NDSRIs的形成，并使用其他仲胺作为模型药物。

评估人类接触杂质的风险

为了评估亚硝胺的毒理学风险，药品审评与研究中心（CDER）的科学家们正与美国国家毒理学研究中心（NCTR）的科学家们合作开展研究项目，以确定评估亚硝胺药物杂质致突变性的最佳方法。

一项研究使用各种组合的细菌测试菌株、孵育时间和代谢激活系统，对12种小分子亚硝胺和17种NDSRIs进行了测试，以确定在Ames试验中检测亚硝胺药物杂质致突变性的最佳方法。另一项合作研究旨在开发可用于跟进和/或确认小分子亚硝胺药物杂质和NDSRIs Ames试验致突变性的体外和体内方法。体外哺乳动物细胞研究使用具有内源性人类代谢活性的人类细胞（例如，表达不同细胞色素（CYP）P450酶的人类淋巴母细胞TK6细胞系）。体内项目使用转基因（Big Blue）大鼠，并使用转基因以及通过纠错下一代测序（ecNGS）来测量突变，同时利用肝脏微核试验评估染色体断裂性和非整倍性。

开发用于简化新ANDA申请人高效应对潜在风险的方法

通过临床研究对重新处方的药品（例如添加抗氧化剂）进行BE重新评估，可能会使健康受试者因接触有害杂质而面临风险，并且耗费更多时间和资源。为解决这一问题，仿制药办公室（OGD）内的研究与标准办公室（ORS）和生物等效性办公室（OB）正在领导开发数据分析工具，以加快BCS评估，支持替代BE方法。对于受亚硝胺影响的药品的BCS评估，提供了一种基于BCS的实用解决方案，并解决了亚硝胺杂质带来的安全问题。目前正在进行进一步的研究和讨论，以正式确定BCS信息并扩展用于受亚硝胺影响的药品的基于BCS的框架。

重要指南修订

2024财年，基于部分由GDUFA资助的研究，FDA修订了行业指南《人用药中亚硝胺杂质的控制》。该修订指南描述了亚硝胺杂质的两大类一般结构：小分子亚硝胺杂质和NDSRIs。指南讨论了亚硝胺杂质的潜在根源，对风险评估、检测和控制等适当策略提出了建议，以防止或减少API和药品中亚硝胺杂质的存在。如果制造商和申请人决定重新处方产品，指南中还提供了替代BE方法的建议。这种替代BE方法同样得到了FDA赞助的研究支持。

研究亮点：新的人源细胞模型评估致突变性

Ames试验用于评估致突变性。然而，对于某些亚硝胺杂质，标准Ames试验的灵敏度可能有限，部分原因是依赖于外源性代谢激活系统（例如，肝脏S9）和物种差异，因此需要进行后续的体外哺乳动物细胞突变试验和体内突变试验，以确认Ames试验的发现。

NCTR的科学家们开发了一种人类肝脏衍生的代谢能力HepaRG细胞培养系统，用于体外遗传毒性试验。基于使用2D和3D HepaRG模型成功评估了八种小分子亚硝胺杂质的遗传毒性，接着科学家们扩展了他们的研究，包括在HepaRG模型中使用ecNGS进行致突变性终点检测。HepaRG 2D细胞和3D球体均暴露于NDMA 72小时，随后进行额外孵育以促进诱导突变的固定，并使用两种高精度ecNGS技术——Duplex Sequencing（DS）和 High - Fidelity（HiFi）测序——测量由NDMA诱导的突变。72小时的NDMA处理导致细胞毒性、DNA 损伤、微核形成和突变频率在两种HepaRG模型中均呈浓度依赖性增加，且在3D球体中观察到的反应显著高于2D细胞。

测序结果显示，NDMA主要诱导A：T→G：C转换，以及在两种HepaRG模型中频率较低的G：C→A：T转换，且在3D球体中观察到的突变频率远高于2D细胞（图 1）。这表明HepaRG模型可以有效地用于使用ecNGS进行致突变性评估，且3D球体在检测NDMA诱导的遗传毒性和致突变性方面比2D细胞更敏感，这可能是由于CYP450基因表达和酶活性水平较高。

总体而言，这项研究引入了一种使用ecNGS 在分化HepaRG细胞中检测亚硝胺诱导突变的新策略，可以提供一个基于人类、具有代谢能力的平台，用于评估其他小分子亚硝胺和NDSRIs的致突变性。此外，使用3D HepaRG球体模型的ecNGS数据可能为人类体内反应提供更好的预测，可能减少不必要的动物研究。