在这个社会化进程愈加快速的时代，不少打工人走上了“过劳肥”的道路。可大家一定要警惕：肥胖不止会“心痛”，还会真实的“心痛”！

随着研究日益进展，人们发现肥胖带来的危害越来越多。肥胖会增加心血管疾病的风险并诱发心肌病，而肥胖心肌病则会导致患者呼吸困难、心衰、心律失常甚至晕厥。有实验表明，巨噬细胞和慢性炎症在肥胖引起的心肌病中起着重要作用，并为该疾病提供新的治疗靶点。

其中，巨噬细胞是国自然课题申请中2022年热点方向之一，中标数高达591，可据此热点发表高分文章和申请国自然。

今天，小编将带大家共同解析一篇近期发表在Nature出版集团旗下刊物《Cell Death & Disease》题为“Macrophage DCLK1 promotes obesity-induced cardiomyopathy via activating RIP2/TAK1 signaling pathway”的研究论文，该文章阐述了巨噬细胞DCLK1在肥胖引起的心肌病中的新作用和促炎机制，将DCLK1确定为治疗该疾病的新靶点。

一、研究背景

肥胖会损害心脏功能，导致血流动力学负荷改变、心肌纤维化和心室收缩能力降低，最终导致心力衰竭。而慢性炎症在与肥胖相关的心肌病发病机制中发挥着重要作用，巨噬细胞通过产生TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎介质，调节心肌炎症，诱导病理性心脏肥大，破坏心脏的收缩和舒张功能。

有研究发现，双肾上腺皮质激素样激酶1（DCLK1）是一种新型的肿瘤干细胞特异性表面标志物，在多种人类恶性肿瘤中具有上升趋势，因此成为治疗癌症的重要靶点。目前有大量关于DCLK1的神经再生和促癌影响的研究，但关于DCLK1参与非恶性疾病发作的研究却很少，在肥胖和心血管疾病中的作用尚未明确。

研究人员在糖尿病和肥胖心肌病的新炎症机制和靶点寻找过程中，发现高脂饮食（HFD）饲喂的肥胖小鼠心脏组织中DCLK1过度表达，巨噬细胞中的DCLK1（不是心肌细胞中的DCLK1）可介导慢性炎症，导致肥胖小鼠心脏组织受损。而DCLK1的药理学抑制或巨噬细胞特异性敲除对模型小鼠的心脏组织具有保护作用。所以将DCLK1确定为肥胖引起的心肌病的新治疗靶点。

二、研究方法

1. 细胞培养

研究人员从新生大鼠的心脏组织中分离了心肌细胞（NRCM）和心脏成纤维细胞（NRCF），培养48小时后，用于实验；从C57BL/6野生型小鼠腹腔分离腹腔巨噬细胞（MPM）。

2. 动物实验

研究人员将野生型C57BL/6小鼠随机分为两组：低脂饮食组（LFD组，n =6）和高脂饮食组（HFD，n =18）。饲喂12周后，HFD组随机分为三组，分别口服DCLK1-IN载体、DCLK1-IN 5mg/kg、DCLK1-IN 10mg/kg。其次，将DCLK1 flox小鼠与Lyz-Cre小鼠杂交，并敲除骨髓细胞谱系（单核细胞、成熟巨噬细胞和粒细胞）中的DCLK1，得到HFD诱导的巨噬细胞特异性DCLK1敲除小鼠。然后，利用Cre-loxP（位点特异的基因重组）技术，将DCLK1小鼠与Myh6基因启动子下携带Cre转基因（Myh6-Cre）的小鼠杂交，得到心肌细胞特异性DCLK1敲除的HFD诱导肥胖小鼠（DCLK1Myh6-cre）。

每周测量小鼠的体重，第20周处死小鼠后收集左心室组织，并进行血液样本的采集、心脏组织的称重和处理。根据血清中CK-MB（肌酸激酶同工酶）和ANP（肽类激素）的水平来评估试验组的心功能。同时，测定血清中甘油三酯、胆固醇、LDL-C和HDL-C的水平，制作心脏冷冻切片，并对其他速冻的组织样本进行了下游基因和蛋白质分析。

3. 细胞转染

在MPM中表达野生型DCLK1或RIP2。

4. 心脏功能评估

对小鼠进行超声心动图检查。

5. 逆转录和实时定量PCR

心脏组织中回收RNA进行逆转录以及定量PCR分析。

6. 蛋白质印迹和免疫共沉淀

对细胞或组织溶解物中提取的蛋白质进行定量和互作分析。

7. 免疫组化检测

将样品制成石蜡切片后脱蜡,采用初级抗体和相应的次级抗体进行孵化。然后加入二氨基联苯胺溶液并进行苏木精复染后，在光学显微镜下观察。

8. 组织病理学

用石蜡包埋心脏组织后，采用H&E（苏木精和伊红）试剂盒对切片进行染色。然后用光学显微镜对心脏组织病变进行评估和记录。

9. 天狼猩红染液和马松染色

将心脏组织包埋在石蜡中，采用天狼猩红染液和马松染液评估肾组织和心脏组织中的胶原蛋白沉积，用单盲法对胶原蛋白沉积进行定量分析。

10. WGA-FITC染色

将组织切片与小麦胚芽凝集素(WGA)-FITC一起孵育后，用DAPI复染细胞核。然后使用荧光显微镜观察。

11. 罗丹明-鬼笔环肽染色

对NRCM进行染色以评估其肥大性改变。用DAPI复染细胞核后使用荧光显微镜观察。

12. 免疫荧光双染

将小鼠心脏切片与一抗孵育过夜后，结合二抗。最后用DAPI进行细胞核染色。

13. 细胞间串扰实验

将MPM与NRCM或NRCF一起孵育。通过心脏肥大细胞标记物来评估MPMCM（条件培养基）对NRCM的影响，并采用qPCR评估NRCF心脏纤维化情况。

14. 细胞因子检测

采用酶联免疫吸附法测定了细胞培养基上清液中TNF-A和IL-6的含量。

15. 转录组测序

16. 统计分析

三、研究结果

为了确定DCLK1是否参与HFD诱导的心脏功能障碍，研究人员分析了它在肥胖小鼠心脏组织中的表达。通过免疫印迹和免疫染色实验，发现DCLK1在心肌细胞和巨噬细胞中都有表达，并且可能与肥胖引起的心肌病的发病机制有关。之后，研究人员利用巨噬细胞和心肌细胞的特异性DCLK1敲除小鼠来研究DCLK1的潜在作用，通过无创超声心动图、生化指标检测和心脏组织切片染色，发现巨噬细胞特异性DCLK1敲除对于最大限度地减少心脏肥大和功能损伤非常有益。

接着，为了探讨心肌细胞中的DCLK1是否会导致肥胖引起的心肌病，研究人员采取心肌细胞特异性DCLK1敲除小鼠，通过超声心电图和心脏组织切片染色检测其心脏功能状态。结果发现，心肌细胞特异性DCLK1敲除无法预防HFD诱导的心脏肥大和纤维化。因此，研究人员对DCLK1进行了药理学抑制，以剂量依赖性方式检测HFD小鼠心脏组织中纤维化和肥大标志物。最终数据表明，与巨噬细胞中的DCLK1敲除类似，DCLK1的药物抑制可预防HFD引起的心脏损伤。

研究人员为了探究巨噬细胞特异性DCLK1如何调节肥胖引起的心肌病，对不同小鼠组的心脏组织进行了RNA测序、KEGG富集分析和免疫荧光染色，发现巨噬细胞特异性DCLK1敲除或DCLK1抑制可通过抑制RIP2/TAK1信号通路减轻HFD引起的心肌损伤。然后，通过探究体外培养的巨噬细胞，发现DCLK1-IN和RIP2抑制剂RIP2-IN显著抑制MPM中PA（棕榈酸酯,与肥胖心肌病相关的饱和脂肪酸）诱导的RIP2/TAK1磷酸化，DCLK1通过RIP2激活促进炎症反应，并且DCLK1在PA诱导MPM中激活NOD1/2独立的RIP2/TAK1促炎症通路。

最后，研究人员考虑到巨噬细胞和心脏细胞之间的细胞串扰会促进肥胖相关的心肌病，所以评估了巨噬细胞分泌因子对心肌细胞和心脏成纤维细胞的影响。通过质粒转染和标志物mRNA水平检测发现，巨噬细胞产生的DCLK1依赖性炎症因子促进心肌细胞肥大和纤维化。

四、总结

在这项研究中，研究人员确定了巨噬细胞DCLK1与肥胖引起的心肌病之间的关系。通过控制RIP2/TAK1信号通路和巨噬细胞激活，研究人员发现DCLK1对肥胖引起的心肌病具有不利影响；而用药物抑制DCLK1，可显著减轻HFD的小鼠的心肌病。

因此，这篇文章证明了巨噬细胞DCLK1在肥胖引起的心肌病中的新作用和促炎机制，靶向DCLK1可能是控制肥胖引起的心肌病的一种可行的治疗或预防方法。

参考来源：
YangB,ZhaoY,etal.MacrophageDCLK1promotesobesity-inducedcardiomyopathyviaactivatingRIP2/TAK1signalingpathway.CellDeathDis.2023Jul13;14(7):419.
网址：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05960-4