背景

亚硝胺，或者更准确地说N-亚硝胺，是指任何含有亚硝基官能团的分子。1937年， Freund首次报道了2例职业接触N-亚硝基二甲胺(NDMA，又称二甲基亚硝胺)中毒案例，病人表现为中毒性肝损害[1]。1956年，英国两位科学家发现，NDMA对实验动物具有很强的致癌活性，自此亚硝胺开始受到人们广泛关注[2]。NDMA和N-亚硝基二乙胺(NDEA)被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构判定为2A类致癌物[3]，ICH M7(R1)指南中明确指出该类物质具有较高致癌性(“关注队列”)，属于高诱变致癌物[4]。WHO在“Information Note Nitrosamine Impurities”中指出，尽管某些食物和饮用水含有亚硝胺，但药物中不应存在这一物质，应予以严格控制[5]。

2018年6月，在血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)缬沙坦中首次发现微量NDMA。2018年7月29日，中国国家药品监督管理局就缬沙坦原料药事件进行公告说明，对问题原料药和涉及的制剂实施召回[6]。2018年10月20日，欧洲药品管理局(EMA)更新了缬沙坦事件的进展：印度的两家药企生产的氯沙坦和厄贝沙坦药物中，发现了NDEA，因此，欧盟将审查范围扩展至所有沙坦类药物[7,8]。

2019年2月8日，因缬沙坦原料药含有可能致癌的杂质(NDMA和NDEA)，涉事药企从日本召回4批次超26万片降压药[9]。

目前的研究显示，药物中N-亚硝胺类杂质形成原因多样、复杂，为确保药物的安全性，ICH M7(R1)[4]列出5种主要亚硝胺杂质的临时允许每日摄入量限值，各监管机构也采取相应措施，控制药品中亚硝胺风险。

美国

美国食品药品监督管理局(USFDA)于2019年9月13日发布安全警告，一些雷尼替丁药物中含有NDMA。截止目前，已经召回特定企业的沙坦类、替丁类(雷尼替丁和尼扎替丁)药物，USFDA要求5家企业主动召回二甲双胍片，同时要求美国市场上所有的二甲双胍生产企业评估各自产品中亚硝胺杂质的风险；根据最大日计量，USFDA列出了缬沙坦、氯沙坦、厄贝沙坦、阿齐沙坦、奥美沙坦、依普罗沙坦、坎地沙坦、替米沙坦共8种ARB中NDMA和NDEA的临时限度，并公布部分检测方法[10]，2020年9月1日，USFDA发布“人用药中亚硝胺杂质控制指导原则”，为原料药和制剂生产企业控制、评估产品中亚硝胺杂质风险提供指导，同时，把由于召回等原因可能导致的药品供应短缺纳入指导原则考虑范畴，并提供解决渠道。该指导原则在发布之日起生效[11]。

200年来，美国药典委员会(USP)始终致力于公众健康事业，其发布的《美国药典-国家处方集》(USP-NF) 是经美国联邦法律认可的法定药品质量标准，由USFDA对美国境内药品强制实施。亚硝胺事件后，USP成立了亚硝胺杂质研究专家志愿者小组，为保证工作中可以听到不同的声音，工作结果能够体现广泛的科学观点，并确保各监管机构和公共标准的协调一致，小组成员由具有丰富和深厚经验的人员组成，涵盖监管(USFDA和EDQM)、药品生产和杂质研究，小组对亚硝胺的成因、控制方法等开展严谨、科学、细致的基础研究；为给企业提供更好的服务，为监管提供更强的技术支撑和保障，2020年6月，USP正式推出6种亚硝胺类杂质标准物质，以增强检测过程的合规性和可溯源性、准确判定、科学评估药物风险：

N-亚硝基二甲胺 (NDMA)
N-亚硝基二乙胺 (NDEA)
N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA)
N-亚硝基二丁胺 (NDBA)
N-亚硝基乙基异丙基胺 (NEIPA)
N-亚硝基甲基氨基丁酸 (NMBA)

2020年7月，USP启动了一系列针对遗传毒性杂质和药品质量的培训活动(Genotoxic Impurities and Drug Quality--Lessons from the Nitrosamine Contamination Crisis)，以提高业界对遗传毒性杂质的认知；2020年9月，USP发布通则“<1469>亚硝胺杂质”征求意见稿，主要包含如下内容：
1. 介绍了亚硝胺类杂质产生途径、控制策略和限度推导、计算方法；根据亚硝胺杂质在药物中微量存在的特点，提供样品制备中应注意问题

2. 推荐了定量方法建立中线性范围(Range)、准确度(Accuracy)、重现性(Repeatability)、中间精密度(Intermediate precision)和定量限(Limit of quantitation)等性能参数的可接受标准，并对专属性(Specificity)等参数做出规定

3. 提供HPLC-HRMS,GC-MS,HPLC-MS/MS以及GC-MS/MS(triple-quad)四种参考定量方法

以上措施既考虑到微量物质测定方法建立中可能存在的仪器特性依赖，为业界提供充分的空间建立自己的测定方法，同时也帮助企业和研究机构在亚硝胺杂质的控制和评估层面更加有章可循，为监管和审查人员提供更为科学、全面的参考[12]。

欧洲

欧洲药品管理局(EMA)首先通过召回等措施消除问题药物的潜在危害，对可能含有亚硝胺杂质的沙坦类药物进行审查，要求各问题药品生产商开展自查、评估、必要时改变生产工艺，以尽可能减少亚硝胺杂质的产生。EMA为药品生产企业提供了两年的过渡期，规定过渡期内同一批次产品中亚硝胺单项杂质的含量应不得超过ICH M7中规定的临时允许每日摄入量限值，同一批次产品中不得同时含有NDMA和NDEA 两种杂质[13]。2020年6月，就上市许可持有人(MAH)如何避免在人用药中产生亚硝胺类杂质提出指导意见[14]，不仅要求评估化学药物中亚硝胺风险，还应评估生物药物的亚硝胺风险。这一更新，首次将亚硝胺杂质的风险评估由化学药品扩展到生物药，同时提出在风险评估之外，对有潜在风险产品进行测试，用量化的结果证明药物的安全性[15]。2020年8月6日， EMA发布了更新后的问答指南文件[16]，指南提供了有关亚硝胺杂质处理的建议并将化学API评估过渡期延长至 2021 年 3 月 31 日，取代了之前 2020 年 10 月 1 日。

2020年4月7日[17]，欧洲药典(EP)发布“亚硝胺杂质分析方法(2.4.36)”征求意见稿，在征求意见稿中，EP提供三种分析流程，涵盖7种亚硝胺杂质，主要针对含有四唑环结构的沙坦类药品中N-亚硝胺的控制，涉及EP中5个各论-缬沙坦(Valsartan)，氯沙坦钾(Losartan Potassium)，坎地沙坦酯(Candesartan Cilexetil)，厄贝沙坦(Irbesartan)和奥美沙坦酯(Olmesartan Medoxomil）。从2021年4月开始，含有四唑环结构的沙坦类药品生产企业必须实施N-亚硝胺的控制策略，产品中不得包含可量化水平(相当于小于0.03 ppm)的两种主要N-亚硝胺杂质:NDMA和NDEA。

中国

国家药品监督管理局(NMPA)在亚硝胺事件后，在及时召回产品的同时，与EMA、USFDA等保持密切沟通和联系，及时关注国际监管机构发布的风险评估公告和动态，同时组织专家开展风险评估。2019年11月，药品审评中心发布“公开征求《关于在原料药工艺中生成亚硝胺类化合物的风险警示》意见的通知”[18]，拟为原料药研究和生产中存在的亚硝胺类化合物控制提供技术指导。在征求意见稿中，对已经上市的原料药，除要求企业保持对产品质量的持续关注、必要时重新评估工艺的合理性、制定相关的控制策略和标准、开展补充研究、向监管部门提交申请变更外，明确要求:

“应选择具有较高灵敏度的测试方法(如GC-MS、HPLC-MS等)对上述工艺路线分析得到的亚硝胺类化合物进行检测和控制，并采用杂质对照品进行完整的方法学验证，如系统适用性、专属性、灵敏度和准确度等，保证亚硝胺类化合物能够准确有效的检出"

继上述征求意见稿后，为了保证药品的安全和质量可控，实现有效的风险控制，为注册申请上市以及已上市化学药品中亚硝胺杂质的研究和控制提供指导，2020年5月8日，国家药品监督管理局药品审评中心再次发布亚硝胺杂质相关指导原则《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)》[19]，指导原则分析了亚硝胺杂质可能产生的原因、提出了“避免为主、控制为辅”的策略，对这类杂质的检测方法，明确强调方法的灵敏度要与杂质限度相匹配，在此基础上，与《关于在原料药工艺中生成亚硝胺类化合物的风险警示》完全一致，再次明确要求：

“采用杂质对照品进行完整的方法学验证，保证亚硝胺类化合物能够准确有效的检出”。

《中国药典》2020年版四部[20]新增“遗传毒性杂质控制指导原则(附录9306)”，提供可用于药物遗传毒性杂质的鉴别、分类、定性和控制的可行性方法，以控制药物中遗传毒性杂质潜在的致癌风险，为上市药物的生产、流通、临床应用和监管提供参考。《中国药典》2020年版二部[21]各论中，对涉及的缬沙坦等6个沙坦类品种，均增订【生产要求】项，要求企业对生产工艺等进行评估以确定形成遗传毒性杂质的可能性，必要时，应采用适宜的分析方法对产品进行分析，以确认杂质含量符合我国药品监管部门相关指导原则或ICH M7指导原则要求。随着《中国药典》2020年版的正式实施，上市产品均应符合新版中国药典的规定，确保上市药品的安全性。

结语

遗传毒性杂质是药品研究、质量控制过程中无法回避的课题，亚硝胺杂质作为遗传毒性杂质的一大类，人们对它的了解、认知都在不断深入。美国药典委员会作为公共标准的制定机构，将与全球监管、药典机构共同努力，致力于解决药物中亚硝胺杂质问题，为公众提供高品质的、安全的药品。

参考文献
1.H.A. Freund. Clinical Manifestations and Studies in Parenchymatous Hepatitis, Annals of Internal Medicine,1937(10)8,1144-1155
2.Advance in Agronomy, Academic Press,2013-01-08, P.159
3.http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL1991/215896.html
4.https://database.ich.org/sites/default/files/M7_R1_Guideline.pdf
5.https://www.who.int/medicines/publications/drugalerts/InformationNote_Nitrosamine-impurities/en/
6.https://www.nmpa.gov.cn/yaowen/ypjgyw/20180729174001758.html
7.https://www.ema.europa.eu/en/news/valsartan-review-impurities-extended-other-sartan-medicines
8.https://www.ema.europa.eu/en/news/eu-authorities-take-further-action-ongoing-review-sartans-zheijiang-huahai-placed-under-increased
9.https://www.fiercepharma.com/manufacturing/pfizer-japan-finds-impurities-its-valsartan-drugs-made-by-mylan
10.https://www.fda.gov/consumers/consumer-updates/what-know-and-do-about-possible-nitrosamines-your-medication
11.https://www.fda.gov/media/141720/download
12.http://www.usp.org
13.https://www.ema.europa.eu/en/news/sartan-medicines-companies-review-manufacturing-processes-avoid-presence-nitrosamine-impurities
14.https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/post-authorisation/referral-procedures/nitrosamine-impurities#guidance-for-marketing-authorisation-holders-section
15.https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/post-authorisation/referral-procedures/nitrosamine-impurities
16.https://www.ema.europa.eu/en/documents/referral/nitrosamines-emea-h-a53-1490-questions-answers-marketing-authorisation-holders/applicants-chmp-opinion-article-53-regulation-ec-no-726/2004-referral-nitrosamine-impurities-human-medicinal-products_en.pdf
17.https://www.edqm.eu/en/news/ph-eur-launches-public-consultation-new-general-chapter-analysis-n-nitrosamines
18.http://www.cde.org.cn/news.do?method=largeInfo&id=1b252859e588d725
19.http://www.cde.org.cn/news.do?method=largeInfo&id=b996c96fd7e72742
20.《中国药典》2020年版四部
21.《中国药典》2020年版二部