寡核苷酸疗法能够直接调控基因表达，它被认为是继小分子药物和蛋白质类药物之后的新一类药物开发热点方向。根据近日发表在Nature Reviews Drug Discovery期刊上的一篇文章，截止2020年1月，全球范围内已经有10款寡核苷酸药物获得美国FDA批准上市，同时还有至少20多款在研寡核苷酸药物进入临床研究阶段。

本文中，我们将结合发表在Nature上的这篇文章，以及公开资料，带大家了解下寡核苷酸疗法的种类，以及当下面临的主要挑战和应对策略有哪些。

小“身材”，大潜力

寡核苷酸是一类包含20 个左右碱基的短链核苷酸的总称，包括DNA或RNA内的核苷酸。寡核苷酸可通过一系列过程来调节基因表达，包括基因沉默、剪接调节、非编码RNA抑制、基因激活、基因编辑等等。因此，这类药物具有治疗多种疾病的潜力。

大多数寡核苷酸通过碱基配对方式与同源目标分子相互作用。此外，核酸还可以通过形成三维二级结构与蛋白质相互作用，这一特性也被用于疾病治疗药物的开发。例如，核酸适配体（aptamers）是一种结构核酸配体，可作为特定蛋白的拮抗剂或激动剂。同样地，含有发夹结构的向导RNA分子也可以与外源引入的Cas9蛋白结合，并将其引导到特定的基因组DNA位点进行靶向基因编辑。

寡核苷酸药物的出现，使精准治疗和个性化治疗成为了可能 ，因为理论上它们可以选择性地靶向任何基因，且具有最小的，或至少可预测的脱靶效应。此外，它们也可以靶向罕见疾病患者的特异性基因序列、特定的等位基因（例如单核苷酸多态性等）、致病性融合转录本、传统的“不可成药”靶点，以及对某种寡核苷酸疗法产生耐药性的病毒序列等等。这些优势和潜力使寡核苷酸成为了当下的研究热点。

十款寡核苷酸药物获美国FDA批准

寡核苷酸作为药物的研究大约始于三十年前。截至2020年1月，已有10款寡核苷酸药物获得美国FDA批准上市。寡核苷酸药物的种类有很多，包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰核糖核酸（siRNA）、微小核糖核酸（miRNA）、核酸适配体等等。

表 1 ：FDA批准上市的寡核苷酸药物

1、反义寡核苷酸

反义寡核苷酸是一种小的、合成的具有不同化学性质的单链核酸聚合物，可通过多种机制调控基因表达。这类药物可细分为两大类: RNase H依赖（RNase H competent）型和空间位阻型（steric block）。

内源性RNase H酶RNASEH1识别RNA-DNA异质双链底物，ASO结合位点的切割导致靶RNA的破坏，从而沉默靶基因的表达。新一代的RNase h型ASOs通常遵循“gapmer”模式，即一个基于DNA的中央“间隙”被基于RNA的侧翼区域包围，促进目标结合。值得注意的是，RNASEH1在细胞质和细胞核中都是活跃的，因此能够靶向其他技术可能难以获得的核转录本。迄今为止，已经有3种 RNase H依赖型ASO药物获得批准上市，分别为fomivirsen、mipomersen和inotersen（见表1）。

空间位阻寡核苷酸可与目标转录本高亲和力结合，但由于缺乏RNase H能力，它们不会诱导目标转录本降解。这类寡核苷酸最广泛的应用是调节可变剪接，以选择性地排除或保留特定的外显子。然而，同样的技术也可以用于剪接破坏，即跳过外显子以中断目标基因的翻译。此外，空间位阻寡核苷酸也可能被用于促进异型转换，从而减少有害蛋白异型的表达和/或促进有益蛋白异型的表达。截至2020年1月，已经有3种剪接转换ASO药物获得FDA批准，分别为eteplirsen、golodirsen和nusinersen（见表1）。

2、小干扰核糖核酸（siRNA）

siRNA是一类双链RNA分子：它的一条链成为引导链（又称反义链），与靶标转录物互补；另一条链为正义链。作为RNA诱导沉默复合物(RISC)的一部分，siRNAs引导Argonaute 2蛋白(AGO2)与目标转录本互补，在AGO2的催化下，引导链的相反位置被切割，进而导致基因沉默。目前至少两种siRNAs药物已获得FDA批准，分别为patisiran和givosiran。

3、微小核糖核酸（miRNA）

miRNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，由具有发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA与多种生理和病理过程有关，包括癌症、细胞周期进展、传染病、免疫、糖尿病、新陈代谢、肌生成和肌肉营养不良，因此成为了新药开发的一个重要靶点。与siRNA一样，miRNA可以将RNA诱导的沉默复合物（RISC）引导至靶序列，从而启动基因沉默。

目前，已有许多公司在开发miRNA药物。例如，Regulus公司正在开发靶向miR-21和miR-17的miRNA寡核苷酸药物，拟分别治疗Alport肾病（Alport nephropathy）、多囊肾(polycystic kidney disease)。miRagen公司正在开发多种miRNA候选药物：其中cobomarsen是一种靶向miR-155的寡核苷酸抑制剂，拟开发治疗皮肤T细胞淋巴瘤；remlarsen是一种靶向miR-29的双链模拟物，拟开发治疗瘢痕疙瘩(keloids)。

4、转录激活RNA

许多基因表达长的非编码RNA，它们通常与近端蛋白质编码基因的转录抑制有关。用ASO或siRNA（称为小激活RNA）靶向这些长的非编码RNA可以逆转这种负调控的作用，从而导致转录激活，这已在许多疾病相关的基因中得到显示，包括BACE1（阿尔茨海默氏病）、BDNF（帕金森氏病）、UBE3A（安格曼综合征）和SCN1A（Dravet综合征）等等。目前，内源性小RNA在细胞核内的重要性已经越来越受到重视，作为转录基因激活或沉默的天然介质，内源性小RNA可能本身就构成了寡核苷酸疗法的靶点。

目前，已有许多公司在开发小激活RNA。例如，MiNA Therapeutics正在开发MTL-CEBPA，这是一种靶向CEBPA（一种参与肝细胞分化和肿瘤抑制的关键转录因子）的小激活RNA，以脂质纳米颗粒制剂的形式递送，用于治疗肝细胞癌。目前，该在研药正在肝细胞癌和肝硬化患者中开展1期临床试验。

激活特定基因的另一种方法是Stoke Therapeutics的TANGO技术平台，该技术靶向非生产性RNA剪接以增加基因表达，并解决由于基因功能丧失或降低而导致的单基因疾病。该公司目前的主要候选药为STK-001。STK-001是一种反义寡核苷酸药物，拟开发治疗Dravet综合征。临床前研究数据显示，在Dravet综合征小鼠模型中，STK-001提高了小鼠的生存率显，并降低了癫痫发作频率。目前，该在研药正在开展1/2a期临床试验。

药物递送——寡核苷酸药物开发的“拦路虎”

虽然全球已经有十余款寡核苷酸疗法获批上市，但寡核苷酸疗法的广泛应用仍面临一个主要挑战——如何将寡核苷酸药物有效输送到肝脏以外的目标器官和组织。迄今为止，大多数寡核苷酸疗法，包括几乎所有已批准的核酸药物，都是局部给药，例如眼睛、脊髓、肝脏。寡核苷酸通常是大的亲水性多聚阴离子，这种特性意味着它们不容易通过质膜。由于基于寡核苷酸的治疗药物通常无法穿越血脑屏障（BBB），因此向中枢神经系统（CNS）的递送是一个额外的挑战。

目前，科学家们正在开发许多方法和技术，来解决寡核苷酸药物递送这一大难题。化学修饰是增强寡核苷酸药物递送的最有效方法之一，这种方法利用修饰来改善寡核苷酸的药代动力学、药效学和生物分布，以提高药物的递送能力。生物偶联也是解决寡核苷酸药物递送的有效途径。ASOs和siRNA的递送潜力可以通过直接共价偶联不同的“元件”来增强，这些“元件”包括脂质、肽、适配体、抗体和糖分子，通过偶联可使寡核苷酸更容易接近目标细胞。

纳米技术和材料科学的发展也为解决寡核苷酸药物递送的挑战提供了优势和潜在的解决方案，尤其是针对跨越生物屏障和跨膜细胞内递送的要求。此外，研究人员也在开发一些新的技术，如内源性囊泡（即外泌体）、球型核酸(SNAs)、纳米技术 (例如DNA笼)和“智能”材料等等。

未来可期

寡核苷酸疗法的到来，让很多疾病的治疗成为了可能。许多药物的获批表明寡核苷酸药物的递送现已成熟，可临床用于多种适应症。根据文章，全球范围内，目前还有至少20多种在研寡核苷酸疗法已在临床开发阶段，适应症涉及亨廷顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化（ALS）、血友病、肝细胞癌等等。

我们期待，在科学家、医药企业、患者组织等社会各界的齐心协力下，寡核苷酸疗法的研究可以取得更多的研究和突破，造福更多患者。

参考资料：

[1]Roberts, T.C., Langer, R. & Wood, M.J.A.（2020）. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-020-0075-7

[2]Stoke Therapeutics官网.Retrieved Aug 26，2020,from https://investor.stoketherapeutics.com/news-releases/news-release-details/stoke-therapeutics-announces-publication-preclinical-data-stk

[3]毛开云 陈大明等.(2018). 全球寡核苷酸类药物开发现状与趋势. 《中国生物工程杂志 》（China Biotechnology），DOI:10.13523/j.cb.20180413

[4] 合全药业寡核苷酸公斤级生产车间正式投入运营. Retrieved Jan 23，2020,from https://www.wuxiapptec.com/zh-cn/news/wuxi-news/3826