细胞移植是神经科学研究中经常使用的一种技术，根据研究方向可以采用多种方法和途径。在移植研究中，移植细胞的存活和融合是不确定的。

对任何移植的免疫反应都是一个重要的考虑因素，因此，许多研究者都用免疫抑制剂治疗移植动物，或使用有免疫缺陷的宿主，如裸鼠，以减少免疫介导的移植细胞的死亡。

如果不需要移植到成年宿主体内，可以在免疫反应完全发展之前在新生儿宿主体内进行移植，以避免免疫抑制。本文概述了如何将Axol人类iPSC来源的神经干细胞移植到新生大鼠(0 ~ 2天)体内。

预期的结果

据估计，在移植后一个月，Axol hNSCs在新生儿宿主中的细胞存活率很高。

移植术后一个月以上的存活率也会被进行评估，尽管随着时间的推移可能会有轻微的下降。

植入的细胞可以利用针对人类的抗体进行识别，如人类核标记HuNuclei (Millipore cat no: MAB1281)，或Axol免疫细胞化学应用协议中概述的其他标记。

成年大鼠皮层冠状切面移植后6周。人特异性NCAM染色细胞，显示除注射部位在胼胝体内，也显示出不同的轴突投射在注射部位周围。中间面板的插入显示了大脑被捕获的中心区域。

所需资料

Axol人类ipsc神经干细胞的培养与分化

请阅读《Axol hNSCs的培养和分化》说明书，以获得细胞制备和所需材料的完整概要。

请注意：Axol hNSCs应培养7 - 8天，最好在解冻后进行。

磷酸盐缓冲液

锥形管(15ml)

微量离心管

Axol Unlock(ax0044)

Axol Neural Maintenance Medium(ax0031a&b)

Axol Sure Boost (ax0045)

血球计

组织培养离心机

经二级生物材料处理认证的垂直层流罩

带湿度和气体控制的培养箱，在空气中5% CO2的环境下，保持37°C和>90%的湿度

倒置显微镜，4倍，10倍和20倍物镜

Axol人类ipsc神经干细胞移植

Axol hNSCs resuspended每μL 50000 - 100000细胞的浓度

装满湿冰的冰桶

带有30号针头的Hamilton注射器(定制)。可以使用其他尺寸，但必须优化黑色精细探针标记

定时器

26号计量针

可方便地塑造成形状的蓝粘胶或类似的材料

平台用于托举小狗在可视化显微镜下的观察和注射。(平台可制成2 ~ 3个100毫米的细胞培养皿装满冰。在平台上放置一个头部固定物或稳定器形状的蓝色大头针)

转笼

带热源的回收笼(可在笼下放置热毯)

带针的立体定位架或注射器支架

手术照明侧灯(如无显微镜)

手术显微镜

程序

收集Axol hNSCs用于移植

请参阅“Axol hNSCs的培养与分化”说明书。由传代的Axol hNSCs微调而来。

从培养容器中取出完整的培养基。

轻轻冲洗表面的细胞层与D-PBS每10厘米(2毫升D-PBS²)通过添加DPBS到培养基的一侧，来回摇晃几次。

添加Axol Unlock以分离细胞(1毫升每10厘米²培养皿表面积)。在37°C的温度下培养三到五分钟。

细胞分离后，用移液管轻轻上下将细胞块分解成单个细胞悬浮液。

通过添加4液量完整的Axol神经维持介质来停止解离反应(例如，如果使用1 mL的Axol Neural Unlock，则添加4 mL的介质来停止酶的作用)。

将细胞移至15毫升锥形试管中，室温下200克离心5分钟。丢弃表层浮液。

将细胞重悬于1ml完整的Axol Neural Maintenance Medium中，并使用血细胞计计数细胞。细胞计数后，在室温下200克离心5分钟。

用1000倍Axol Sure Boost原液，将复苏细胞补充进理想数量的Complete Axol Neural Maintenance Medium。例如，1μL Axol Sure Bosst每毫升介质。细胞应该放在温暖的温度下，如果可能的话37°C为宜，或者在室温下保存更短的时间(最多2到3个小时)也足够了。

注意：最佳浓度细胞移植是50000 - 100000细胞/μL。

新生幼崽移植过程

完整的幼崽都应该从母亲的笼子里拿出来，放到转移笼子里。从母亲的笼子里拿出一些被褥放到转移笼里，让幼犬维持在同样的气味和环境中。这将阻止母亲拒绝幼崽被重新放回母亲的笼子。

麻醉在冰上的第一个的动物大约5分钟。动物被麻醉后，将动物转移到平台上(含冰继续低温麻醉)。

注：本方案强烈建议在麻醉过程中使用低温疗法。吸入性麻醉是可以使用的，但它是非常不稳定的，由于新生儿的呼吸模式特点，所以不适用于这个年龄。

注射麻醉也不推荐，因为在这个年龄注射麻醉有很高的死亡率。如果不熟悉这些流程，请向当地或国家监管部门咨询并寻求兽医建议。将平台置于立体定位架内，置于显微镜下观察动物头部。

注意：这个年龄的动物不能用成人耳架抱着，所以要小心确保平台固定在合适的位置，不要移动。向Hamilton注射器(30号针头)注入所需数量的细胞，注意不要堵塞针头尖端。改变在立体定位架上的针座中的针。

注：50000 - 100000细胞/μL 30针规是应用于最好结果的最小标准。通过皮肤可视化发现前囟(白化大鼠是最容易可视化的)。用黑色马克笔在前囟上做一个小标记。

将您的针集中在bregma的中心，并继续通过操纵针座到首选的注射区域来找到您想要的坐标。

注：坐标会根据你的注射位置而改变。查阅适当的脑图谱或已发表的文献以获得更多信息。对于P0幼犬的拟定感觉运动皮层，以下坐标可用于两次单侧注射：- 1.0mm AP, 1.0mm ML， -0.5mm DV;AP -0.5mm, ML - 1.0mm, DV -0.5mm。它有助于在主要注射前要在颅骨上开一个适当的孔，首先插入一个26号针到所需的注射部位。完成后，注射针就可以插入。注入约0.5 1μL /每注射点，如果使用许多注射部位就要减少。有关注射量限制，请参阅地方和国家规定。

进行人工注射，每次注射一分钟，然后在取针前等待两分钟。重复所需的注射次数。

注：如果需要，可以使用注射泵，但在使用低温麻醉时，应尽量减少注射次数。对于较长的注射时间，可以使用吸入麻醉剂。当注射完成后，将动物转移到一个温暖的恢复笼中，并从原来的笼中取出被褥，以确保保持家庭笼内的气味，并将母亲排斥的风险降至最低。

对所有的幼崽重复这个步骤。手术被有效进行后，考虑在注射另一只动物的同时进一步麻醉其他动物。确保时间被记录，以便手术前体温降低的时间不会超过5到6分钟。总的来说，全身麻醉时间最好不要超过10 - 14分钟。

在这个年龄上，很难给通过给每只动物都做上标记来唯一地识别它们。最好不要这样做，以避免干扰幼崽和被母亲母亲阻止注射。尾巴上做标记没有意义，因为母亲会在一天之内把动物身上所有的标记都清除掉。耳朵修剪是一种可能性，但也不可取，因为这可能会给母亲带来压力。

关于AXOL生物科学

Axol专门研究人类细胞培养。

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如果没有经过优化的介质、涂层溶液和其他试剂，包装就不完整。我们的内部研发团队努力改进现有的培养基和试剂，并为人类细胞培养创新型产品。我们还供应越来越多的人类初级细胞；使Axol变成为你提供所需人类细胞培养第一个港口。

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