基因治疗（genetherapy）：指用（正常或野生型）基因导入人体的细胞，使其发挥生物学效应，从而达到治疗疾病目的的技术方法。 

基因治疗是随着20世纪七八十年代DNA重组技术、基因克隆技术等的成熟而发展起来的最具革命性的医疗技术之一，它是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段，在重大疾病的治疗方面显示出了独特的优势。经过三十余年的发展，基因治疗已经由最初用于单基因遗传性疾病的治疗扩大到6000多种疾病，如艾滋病、乙肝、癌症、镰刀贫血症、血友病、黏多糖贮积症III型、遗传性精神病、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和代谢性疾病等。基因治疗技术的突破使得基因治疗入选Sicence2009年度十大突破之一，并发表了专栏文章“A Comeback for Gene Therapy”。

一般来说，治疗用的基因并不能直接导入到人体细胞中，这个过程需要借助某种载体（工具）。常用的载体分为病毒载体和非病毒载体两种。在当前的研究中，最常用的载体（工具）是病毒载体。所有的病毒都具备攻击宿主细胞并将其体内的遗传物质导入宿主细胞的能力。病毒的遗传物质，即病毒的基因组，能够“绑架”宿主细胞正常的蛋白表达系统优先对生产病毒蛋白，从而实现病毒快速自我复制的能力。 

随着技术的发展，现在基因治疗临床研究中主要使用腺相关病毒和反转录病毒为主。腺相关病毒被证明是一种对人体完全无害，且导致的免疫反应不明显的病毒。这种病毒能够将“治疗基因”多如宿主细胞内，让其长时间的表达，这种载体比较适合针对那些长期不分裂的细胞的基因缺陷治疗，如基因变异导致的眼科疾病或者心血管疾病。反转录病毒能够将“治疗基因“整合进宿主基因组内，使“好基因”能够传递到宿主细胞分裂或者分化的下一代细胞中。因此，反转录病毒载体往往用于对造血干细胞的基因改造，往往用于血液相关的遗传疾病或者癌症的治疗。

1、基因治疗的给药方式和靶点细胞 

当前基因治疗的临床研究均是针对体细胞的基因改造。从基因导入的途径来看，分为体外导入和体内导入两种途径：

体外导入：是指将要需要进行基因改造的细胞(如造血干细胞、血细胞等)从患者体内提取出来，在体外与病毒载体混合，完成对提取细胞的基因改造。然后将改造过的细胞重新注入患者体内的方式。 

体内导入：是指直接通过注射等方式将病种载体注入患者病变部位的方式。

从导入的靶点细胞来说又分为体细胞和生殖细胞两种。针对体细胞的基因治疗其效果只限制在患者本人，所改变的基因并不会遗传给后代，在遗传学、伦理学风险上具有一定的可控性。所以体细胞导入是现在主流的临床研究手段。在美国，现在有超过600个关于体细胞导入的基因治疗临床试验在进行中。大部分临床试验针对的都是一些单基因突变所导致的疾病，例如艾滋病、血友病、地中海贫血症、囊肿性纤维化等。对生殖细胞的基因改造理论上来说可以更高效的解决患者的基因缺陷，并使得正常的基因可以遗传给后代，但考虑到伦理问题以及技术的成熟度问题，在许多国家，例如澳大利亚、加拿大、德国、以色列、瑞士、荷兰等都立法严格禁止对生殖细胞的基因治疗。美国虽然没有相关的立法，但当前的研究主要还是集中在对体细胞的基因治疗领域。 

2、癌症的基因治疗 

基因沉默治疗：RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。研究表明，一些重要的信号通路和基因在肿瘤的发生发展中起关键作用。因此，应用RNAi技术降低这些信号通路里的关键分子及一些重要的癌基因的表达水平，是一种非常有效的策略。RNAi可以特异性地抑制癌细胞内致癌基因表达，而不影响正常细胞的基因表达。其中小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可以产生多基因沉默的效果，从发现到现在短短十几年时间内，很多学者、生物公司和制药公司已经开始广泛利用siRNA治疗肿瘤。2008年美国Calando Pharmaceuticals公司申请的治疗实体肿瘤的siRNA药物CALAA-01被FDA批准进入临床一期实验，是首例siRNA药物治疗癌症的临床试验。2009年7月德国Silence Therapeutics公司开展的靶向实体瘤的RNA干扰的临床一期试验结果显示：24名患者经过Atu027药物多次治疗后，9名患者病情稳定，6名有较好的疗效，其余患者正在接受治疗。 

抑癌基因治疗：抑癌基因(tumor suppress gene)也称为抗癌基因，在被激活的情况下它们具有抑制细胞增殖的作用，但在一定情况下被抑制或丢失后可减弱甚至消除抑癌作用。目前已分离克隆出20余种抑癌基因，例如p53基因。

免疫基因治疗肿瘤：最常用的肿瘤免疫基因治疗是将细胞因子导入体细胞，制造利于提高抗肿瘤免疫应答的微环境，从而达到肿瘤治疗的作用。

自杀基因治疗肿瘤：自杀基因(suicide gene)，是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。自杀基因治疗系统的种类很多，主要包括单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV2tk/Ara2M)系统、硝基还原酶/CB1954(NTR/CB1954)系统、ICE基因等。 

Tocagen公司的Toca 511和Toca FC联合疗法获FDA孤儿药地位授权，用于治疗恶性胶质瘤。在该联合疗法中，Toca 511是一种逆转录病毒复制载体，可将胞嘧啶脱氨酶(CD)的基因选择性地递送入癌细胞。在Toca511遍布肿瘤后，可表达CD基因的癌细胞就能将氟胞嘧啶(5-FC)转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)，进而介导肿瘤细胞程序性死亡，并增强机体对肿瘤的免疫应答。Toca 511和Toca FC联合疗法于2015年开展II期和III期临床试验，根据临床中期报告显示，经联合治疗后，恶性胶质瘤患者中期存活率达到13.8个月，优于7个月的中期存活率历史基准点，表现出较好的临床疗效。

肿瘤耐药基因治疗：化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一，然而由于肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感，最终导致化疗失败甚至疾病复发。根据肿瘤细胞的耐药特点，耐药可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两大类。原药耐药(PDR)是指对一种抗肿瘤药物产生抗药性后，对非同类型药物仍敏感；多药耐药性(multiple drug resistance，MDR)是指一些癌细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性，同时对其他非同类药物也产生抗药性，是造成肿瘤化学药物治疗(化疗)失败的主要原因。

溶瘤病毒的肿瘤治疗：人们发现利用病毒可以治疗肿瘤，发现了许多病毒具有天然的溶瘤特性，如流感病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河脑炎病毒、新城疫病毒和痘苗病毒等。由于野生型和弱毒株病毒的致病性很难人为控制，所以无法将这些病毒应用于癌症的临床治疗。随着病毒学和遗传学的发展，各种病毒基因的功能和作用机制日益清楚，并且随着基因工程等技术的进步，人们已经能够对病毒基因进行各种定向操作和改造，从而定向地改变和控制病毒的行为和功能。1991年首次对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)进行基因改造，使其胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)基因失活，建立了能抑制癌细胞并具自主复制活性的溶瘤病毒株。之后，利用溶瘤病毒治疗癌症的策略和研究得到飞速地发展。继HSV-1后，腺病毒和牛痘病毒等重组基因病毒进一步被开发；另外，野生型病毒或自然变异的弱毒病毒株基因改造的研究也取得了很好的效果。

相比较其他领域尚处于临床一期和二期的项目，肿瘤领域将成为近期有望上市较多产品的治疗领域。乳腺癌、子宫颈癌、直肠癌、肺癌、黑色素瘤、神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾脏细胞癌等多种肿瘤领域最有希望有产品上市。特别是黑色素瘤、头颈部癌和前列腺癌，被认为最有希望在美国上市 

IMS数据显示，2014年全球抗肿瘤药物市场规模为1000亿美元，2020年将增至1500亿美元。具有靶向性、特效性和低毒性等特点的抗肿瘤单克隆抗体药占34%，达到238亿美元。使用单抗药物的价格和基因治疗价格类似。其中治疗乳腺癌著名单抗药物“赫赛汀”，该药物是治疗乳腺癌的重磅产品，2013年的全球销售额达68.39亿美元，2014年销售额达62.7亿美元。如果基因治疗在癌症上的疗效显著，能替代单抗药物，其市场预期在238亿美元。

3、第三代基因编辑技术：CRISPR-Cas9

成簇规律间隔短回文重复序列系统技术(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR associated proteins)：第三代基因编辑技术，能够同时实现多个基因的编辑，靶向效率更高。操作简单，构建成本低，编辑效率高。目前，CRISPR 已经不仅仅是一套可以精确剪切任何基因的多功能剪刀，而且可以作为一个多功能传输系统，精确控制任何基因。

目前广泛使用的 CRISPR/Cas9系统主要可分为体外和体内两种不同的应用。针对体外的应用主要以纯化的Cas9核酸酶配以向导RNA，用于在体外对基因组片段进行靶向切割以替代传统的限制性内切酶或PCR克隆。针对体内的应用主要有两种组合方式，一种是活性形式，即带有核定位信号的纯化的Cas9核酸酶，配以纯化的向导RNA，进入细胞核后对基因组发挥定向剪切作用；另一种就是以载体的形式将Cas9和向导RNA送入细胞，在体内表达和转录后发挥作用。两种体内应用主要在细胞或个体水平上实现基因的敲除和插入的基因编辑。 

4、CRISPR 和细胞治疗(CAR-T)的结合：最先进的肿瘤治疗技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)技术：是将人为设计的针对某种肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原单链抗体-CAR通过基因工程方法引入T细胞表面，重新定向T细胞的免疫反应，使T细胞能够以非HLA分子限制性的方式识别肿瘤细胞，发挥杀伤作用。CAR-T存在的问题：CAR-T具有特异性高、疗效显著、副作用低等优点，其常见的副作用包括细胞因子释放综合征、脱靶毒性等，应用难点包括实体瘤治疗效果较差、无法供应现货。

目前，借助CRISPR技术，CAR-T技术已经成功升级：CRISPR技术可高效多点地定向编辑T细胞，有效解决副作用强烈、实体瘤效果较差、个体疗效差异大以及难商业化等问题，因此，CRISPR和CAR-T的联合有望迅速推进临床试验并实现工业化生产。

国外CAR-T疗法巨头纷纷投资CRISPR技术：目前几乎所有的CAR-T疗法公司都和基因编辑公司开展合作，包括诺华、Juno和Cellectis在内的6家CAR-T疗法企业与Intellia Therapeutics、Editas Medicine和CRISPR Therapeutics等基因编辑公司强强联合，开发结合CRISPR技术和CAR-T疗法结合的项目。Novartis公司是全球 CAR-T技术研发进展最快的公司，预计诺华的CTL019第一个适应症急性淋巴细胞白血病将于2016年内获批，2017年还将获批慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等两个适应症。诺华和CRISPR技术巨头Intellia展开了一项长达5年的研发合作计划，将 CRISPR与CAR-T更好地结合，致力于加速发展CRISPR/Cas9技术在CAR-T细胞治疗在造血干细胞中的应用。 

在基因治疗过程中，特别是恶性肿瘤的方案中，只能直接载体注射到肿瘤局部。若静脉注射，载体将会很快被清除，难以达到治疗效果。科学家们设计不同的方案，改造载体的结构，构建了不同类型和特征的靶向载体。如将不同的配体组分交联到病毒载体的外膜上，构建靶向转导载体；或在载体的DNA中引入顺式调控元件，构建靶向转录载体等等。这些载体的构建有力地推动着基因治疗的发展。 

病毒载体插入或者和到基因组随机位臵，有引起插入突变及激活癌基因的潜在风险。例如：过去被认为无害的AAV2腺相关病毒实际上与肝细胞癌有关，虽然AAV2 DNA插入引发癌症可能性比较少，但是也应该引起高度重视；2000年时，宾州大学有病人在基因治疗中死亡；2002 年在法国又发生先天免疫不全症 bubble boys 基因治疗临床试验发生白血病的副作用。这两件失败的案例，皆被归因于病毒载体的不安全性。 

病毒载体免疫原性较强，高滴度时有明显的细胞毒性。解决方法是采用非病毒传递系统，例如阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、脂质体、聚乙烯亚胺等生物相容性载体将成为一套很有前景的基因传递系统。非病毒传递系统在遗传病的基因治疗方面应用显示出优势，也被越来越多用于治疗恶性肿瘤、感染性疾病以及组织工程研究。

理想的基因治疗应该能够根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因的适当的表达。但是和基因治疗载体系统相比，治疗基因表达调控的研究相对滞后。可以运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数、连接启动子或增强子等基因表达的控制信号。相信随着人类基因组学的发展，问题会得到很好的解决。 

5、基因治疗的未来 

基因治疗应用广泛随着基因治疗技术的发展，基因治疗已经由最初用于单基因遗传性疾病的治疗扩大到6000多种疾病，如艾滋病、乙肝、癌症、镰刀贫血症、血友病、黏多糖贮积症III型、遗传性精神病、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和代谢性疾病等。目前，基因治疗正在经历从罕见病到不十分罕见的疾病，最终到普通疾病的发展过程。疾病的致病机理也是从简单到复杂。随着对普通疾病治疗的推进，基因治疗技术将日益成熟并实现巨大盈利。

CRISPR为首的基因治疗技术蓬勃发展2015年12月，美国《科学》杂志公布了其评选的 2015 年十大科学突破，CRISPR 基因组编辑技术当选今年头号突破。基因治疗受到各国青睐2015 年底，白宫再次发布《美国创新新战略》，报告中明确把包括基因治疗在内的精准医疗作为美国在医疗领域的未来发展战略。中国精准医疗计划将在2016年启动，计划2030年前投入600亿。在全世界看好精准医疗的大背景下，市场对基因治疗相关公司充满了信心。基因治疗受到资本市场关注对于基因治疗相关的医药公司，上市产品少(甚至未有产品上市)，科研投入大，都影响了公司的盈利。但是丝毫不影响资本市场对其热情。基因治疗公司在股市上的表现抢眼：基因治疗龙头企业Blubirdbio上市一年半，股价涨幅高达十倍。CRISPR 发明者张峰创办的Editas Medicine公司，上市首月涨幅超过130%。除此之外，基因治疗相关公司 还积极开始IPO，2016年5月16日，Editas Medicine与Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics(CFFT)宣布了一项为期3年、价值500万美元的合作；同日，Caribou也宣布了一项好消息，公司完成3000万美元B轮融资，新的投资者包括Anterra Capital、Heritage Group、Maverick Capital Ventures以及Pontifax AgTech，参与此轮融资的原有投资者包括F-Prime Capital Partners、诺华、Mission Bay Capital以及5 Prime Ventures。

各大世界级药企加快布局世界级国际药企通过各种方式进入基因治疗领域，例如：合作、购买、投资和独立研发。其中，GSK 基因产品Strimvelis的成功上市，也为基因治疗领域的发展树立了成功的典范：项目前期由非营利组织(意大利 Telethon 基金会) 资助完成，后期由世界级药厂GSK完成，双方签署协议，实现从研发到上市。2011年，制药巨头安进以4亿2千5百万美元的价格加上5亿7千5百万美元里程碑奖金的代价获得了Biovex开发的Imlygic，2015年10月份，FDA正式批准上市。 

未来可能的市场催化剂大量临床三期实验数据将披露：截至2013年底，近2000 项基因疗法试验中，有大约5%到达了III期临床阶段，经过三年的实验周期，批量三期实验即将完成。世界级医药公司对基因治疗的投入将加快产品上市过程：以GSK 为首的世界级药企和生物公司以及研究所进行合作，从临床三期接手，完成商业转化。Spark Therapeutics公司针对RPE65遗传性视网膜营养不良的基因治疗药物计划在2016年获得美国FDA批准。诺华CAR-T疗法、Juno Therapeutics的CAR-T治疗产品 JCAR15用于成年急性淋巴细胞白血病和Kite公司的KTE-C19用于弥漫大B细胞淋巴瘤都有望在2016年提交上市申请，值得关注的是CAR-T和CRISPR技术的结合。

（本文是威斯腾诊断创始人周勇原创，欢迎转载，转载请注明出处）

【作者简介：周勇，高圣医药创始人/董事长、威斯腾诊断创始人/董事长、高创汇生物医药转化平台联合创始人、北京市海淀区生物与健康产业协会副会长、重庆市医药行业协会副会长、重庆市高层次人才特殊支持计划人选、重庆市创新创业领军人才】