新方法允许“20,000个平行实验”来寻找基因激活剂

来源:

加州大学旧金山分校

简介:

一个研究小组使用了一种修改过的基因编辑技术——CRISPR来寻找增强子——不是通过编辑而是通过促使他们采取行动。

我们的每一个细胞在基因组中都有大约2.2万个基因，但每个细胞都使用不同的基因组合，在它们的角色和情境需求的情况下，将它们打开或关闭。正是这些表达和抑制基因的模式决定了哪种细胞——肾脏、大脑、皮肤、心脏——每一种细胞都将变成。

为了控制这些变化的模式，我们的基因组包含了调控序列，可以根据特定的化学线索对基因进行开启和关闭。在这些基因中，“增强子”序列可以让成千上万的基因字母远离基因，但在激活时仍会使其超负荷运转。在这种微妙的编排中，失误可能导致细胞扮演错误的角色，导致令人虚弱的疾病，但相关的监管区域很难找到和研究，因为它们只在特定的细胞中发挥作用，通常在特定的条件下。

现在，由加州大学的科学家们领导的一个研究小组使用了一种修改过的基因编辑技术CRISPR来寻找增强子——不是通过编辑它们，而是通过促使他们采取行动。在线8月30日报道,2017年聽自然,一个团队从旧金山加州大学和加州大学伯克利分校使用工具叫做CRISPR激活(CRISPRa),开发了加州大学旧金山分校2013年,搜索增强子的基因影响的发展被称为T细胞的免疫细胞。他们发现的序列显示了自身免疫疾病的基本回路，如炎症性肠病(IBD)和Crohn的疾病。

这项工作是在Alexander Marson的实验室里进行的，他是加州大学的微生物学和免疫学助理教授，以及加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学助理教授，雅各布玉米博士。

“我们不仅可以找到这些监管区域，而且我们可以这么快、很容易地做到这一点，”玉米说。他说:“要找到一个人需要几年的时间，但现在只需要几个月就能找到几个人。”

玉米是创新基因组研究所(尼基)的联合创始人和科学主任，这是加州大学伯克利分校的一项倡议，Marson是一个附属成员。在医学和农业领域，为了治疗人类疾病、消除饥饿和保护环境，在医学和农业方面进行了基于crispr的基因编辑工作。

CRISPRa打开增强剂

CRISPR的出现使研究人员能够在理解蛋白质编码基因方面取得快速进展。在CRISPR最常见的应用中，一种叫做Cas9的酶，通过“导RNA序列”的序列指定特定序列的DNA。“利用这项技术，科学家可以切除或编辑任何基因，观察这些变化对细胞或整个生物体的影响。”

但是，直接编码蛋白质的序列只占我们基因组的2%。在其他98%的基因中，增强子和其他的调控DNA元素更加难以研究，但它们与大量的遗传疾病有关联。科学家可以根据与DNA结合的蛋白质的相互作用来寻找潜在的增强子序列，但要找出哪些增强子与哪些基因更具有挑战性。简单地用crispr-cas9去除增强器是没有用的，因为如果增强器在实验中使用的特定细胞类型中是不活动的，它就不会有明显的效果。

如果你把基因组想象成一个拥有22000个灯泡(基因)和成千上万个开关(增强子)的模型，那么挑战就是找到所有的开关，并找出它们控制的灯泡和什么时候的开关。在此之前，CRISPR已经被用来切断电线，寻找那些能使灯泡变暗的电线，从而更好地了解电路的这一部分在做什么。但是，在关闭的时候切断一个电灯开关并不能告诉你它控制了什么。所以，为了找到某些光开关，我们很常见的是试图模拟激活增强器的复杂的化学信号。

但是，使用这种方法，“你可以很快地去寻找一个增强剂，”Benjamin Gowen说，他是伯克利的玉米实验室的博士后，也是该研究的主要作者之一。

一种更好的方法是一种通用的“on”开关，它可以瞄准基因组的任何部分，如果这部分包含了增强器，就可以激活增强器。幸运的是，CRISPRa，最近由Jonathan Weissman博士，加州大学的细胞和分子药理学教授，以及“木”的联合主任，是一个工具。CRISPRa使用一种“迟钝”的dna切割Cas9蛋白质，绑在一组激活蛋白上。尽管CRISPRa也使用引导RNA来定位基因组的精确位置，而不是切割DNA，CRISPRa可以激活该区域的任何增强剂。

虽然CRISPRa的第一个应用是使用单一的引导RNA来寻找启动子——在基因的旁边是帮助打开它们的基因序列——但这项新研究背后的ucsf/伯克利团队意识到，CRISPRa也可以帮助找到增强剂。他们推断，通过将CRISPRa复合体定位到数千个不同的潜在增强位点，他们将能够确定哪些基因具有开启特定基因的能力，即使该基因远离了染色体上的增强子。

“这是一种从根本上不同的看待非编码规则的方式，”Marson说，他是加州大学的Dimitre Simeonov实验室的博士生，也是该研究的另一名主要作者。

同时进行2万次实验

研究小组选择研究的基因产生一种叫做IL2RA的蛋白质，这种蛋白质对免疫细胞T细胞的功能至关重要。根据身体的条件，T细胞有能力触发炎症或抑制它。IL2RA基因产生一种蛋白质，它告诉T细胞，是时候戴上它们的抗炎帽子了。如果该基因的增强剂有错误，细胞就无法抑制炎症，这可能会导致像Crohn的疾病一样的自体免疫疾病。

为了追踪控制IL2RA的增强子的位置，加州大学和伯克利分校的研究小组生产了2万多种不同的指南rna，并将它们放入T细胞中，并带有一种经过修饰的Cas9蛋白。

Marson说:“我们基本上进行了2万次实验，以找到所有这些基因的序列。”

可以肯定的是，针对某些与CRISPRa有关的序列，增加了IL2RA的产量，从而产生了一系列可能对调节T细胞命运至关重要的位置。

Gowen说:“每当你有机会以一种全新的方式问一个问题时，你就会突然发现你可能会错过的旧方法。”“我们发现了这些增强剂，而无需对它们的外观做出任何假设。”

将突变增强剂与炎症性疾病联系在了

研究小组发现的一个可能的增强基因序列包括一个常见的遗传变异的位点，该基因变异可能会增加患IBD的风险，但它是如何做到这一点的尚不清楚。Marson和玉米的团队想知道，这种基因变异是否会改变调节T细胞内的IL2RA蛋白的数量。为了验证这一点，他们对小鼠T细胞进行了修饰，使其包含与人类疾病相关的基因变异，并发现这些T细胞确实产生了更少的IL2RA。

Marson说:“这将开启免疫细胞调节的基本回路，这将极大地增加我们对疾病的理解。”

下一步，研究小组希望扩大这种方法，也许是通过寻找方法，同时寻找多种不同基因的增强剂，从而使免疫紊乱的管理者更快地寻找。他们希望这种方法是一种广泛适用的工具，可以在各种细胞中解开基因的相互作用。

“我们相信这将是一种非常有用的方法，”玉米说。“对于那些对神经元或任何其他细胞类型感兴趣的人来说，将其捡起来并寻找参与这些细胞行为的增强因子是很容易的。”

其他作者的研究包括西奥多·l·罗斯Youjin李约翰d . Gagnon爱丽丝y . Chan Dmytro s Lituiev米歇尔·l·阮,雷切尔·e·门,弗雷德里克·范干傻事,埃里克·波伊尔之一Meena苏,乔纳森·m·吴Zhongmei Li维多利亚r·托宾凯瑟琳舒曼,k .马克•安塞尔春,威廉·j·格林利马克·s·安德森和加州大学的杰弗里·a·青石;Nicolas L.Bray、Mandy Boontanrart、Nicki Naddaf、格雷厄姆j雷、Gemma L.Curie、Nicolas L.Bray、朱莉亚和伯克利的洪马;Ansuman T.Satpathy，霍华德，张，和斯坦福大学的Maxwell R.Mumbach;Ruize Liu，Ruize Liu和哈佛大学的Mark J.Daly;Kyle K.Farh的公司。

这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持(授予dp3dk111914-01、r01hg0081410-01、R01HL109102、p50-hg007668、S10RR027303和P30 DK063720)，硬皮病研究基金会、UCSF桑德勒奖学金、Jake Aronov的礼物、国家多发性硬化症协会(CA 1074-a-21)和马库斯计划Marson和Marson已经提交了一项专利，利用Cas9核蛋白来编辑人类主要造血细胞的基因组。张和Greenleaf是epin经济学的联合创始人。Marson是朱诺疗法和协议疗法的顾问，而马森实验室已经获得了朱诺疗法和epin基因组学的赞助研究支持。