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如果你干扰了DNA修复,那么CRISPR-Cas9能够更好地打破基因
发布时间: 2016-09-07     来源: 麦肯息讯

在切割和修复之间竞争,增加的DNA片段提升了切割的有效性

资料来源:

加州大学-伯克利分校

摘要:

    流行的基因编辑工具CRISPR-Cas9与DNA修复相竞争,不断切割修复酶所修复的物质,直到出现错误,产生一个破碎的基因。这形成一个行为,改善Cas9蛋白质的切割效率。将随机量的非同源DNA倒入具有Cas9的细胞中,它们会干扰DNA的修复程序,促进人类细胞系上基因敲除率增加了五倍。

    CRISPR-Cas9是一种协助式技术,敲除人类细胞系中的基因,研究基因的行为,同时其破坏的基因的效率将可能会极大地改变。

    美国加州大学伯克利分校的研究人员目前发现了一种方式促进CRISPR-Cas9在大多数类型的人类细胞中切割及破坏基因的效率提升五倍,从而令创造和研究敲除细胞系更加容易,并且很有可能作为一种人类治疗方式破坏突变基因。

    科学家们不断发现新的需要进行编辑的基因或蛋白质,但是人们很难弄清楚它们在身体内部或疾病中所起的作用。研究这个作用的关键在于破坏基因以查看当该基因被去除后会发生些什么。

    虽然CRISPR-Cas9能够加快敲除细胞系的程序,但是研究人员有时必须进行并且筛选基因剪刀的多种变形,从而找到最为有效的一个。UC伯克利分校的研究人员发现,这个过程在一个简单的微调之后效率能够提升很多倍。

    将CRISPR-Cas9蛋白质一同引入细胞的关键在于DNA的短片段,这种片段与人类基因组中的任何DNA序列都不匹配。该DNA的短片段称为寡核苷酸,似乎会与细胞DNA修复机制相互干扰,从而能够将即使平庸的CRISPR-Cas9s的编辑性能提升2.5到5倍。

    “事实证明,如果你做一些非常简单的事情——只是向细胞提供廉价的在人类基因组中没有任何同源性的合成寡核苷酸——编辑率都能够增加多达五倍,”主要研究员兼UC伯克利分校创新基因组计划的科学主管以及分子和细胞生物学的兼职副教授雅克布·科伦称。该技术提升了所有CRISPR-Cas9s的有效性,即使是那些最初完全没有效用的CRISPR-Cas9s。

    通过更高的效率,研究人员将能够在创建他们期望的基因敲除方面获得更好的成功,从而利用这些基因敲除基因系来研究基因的功能或是一组基因的功能。由于最为长寿的细胞系源自于肿瘤细胞——包括非常流行的HeLa细胞系——这些细胞系在每个基因上通常拥有的不止是正常的两个复制体。这使得一次性敲除所有的复制体变得非常困难,并且较高的有效性极大地增加了成功的概率。

    在敲除基因纠正人类基因突变时,高效也同样至关重要。医生们推测敲除那些令人们易感染传染性疾病的基因,例如AIDS,或者易出现自身免疫、炎症或神经退行性疾病的基因。科伦及其同事们描述的这个方法是否能够用于治疗环境还有待观察,但是用于研究目的是非常有效的。

    该研究结果将于8月17日在线发表于《自然通信》杂志。

     DNA修复对于CRISPR-Cas9的成功至关重要

    CRISPR-Cas9分子是由一个蛋白质剪刀、Cas9蛋白质以及一个告知Cas9在哪里与DNA结合以及切割的地址构成的。该技术依赖于一个事实,即,当你切割DNA时,细胞的修复机制并不总是会正确地重建DNA链,而是在序列中产生一个错误,破坏基因并且敲除其活性。

    该地址,称为导向RNA,是一系列20核糖核酸分子,与目标基因的DNA序列相互补。导向RNA与DNA像一条粘扣带一样结合在一起,设定Cas9来切断双链DNA。

    为什么一些导向RNAs作用良好,设定Cas9近乎100%地切断并且破坏一个基因,而其他导向RNAs则会结合在一起,而很少或者从不会敲除基因,这是一个自该技术于2012年由UC伯克利分校的詹尼弗·道德那以及默奥大学的艾玛奴埃勒·沙潘提尔发明以来一直都未解开的谜题。切割效率随细胞类型以及特定的细胞系的变化而变化,科伦称。

    科伦怀疑,Cas9偶尔出现的较差切割效率可能与DNA修复地方式有关,因为DNA修复机制——在可能引起致命性突变的DNA中修复任何破损或缺失的基本看家酶——在各个细胞中都有所不同。他的理论在于,随机系列DNA——其中没有与任何实际的人类DNA具有相似性的DNA(即非同源)——可能令修复过程混乱,并且提高基因敲除的成功率。

    “这为细胞提供了一个小型的反冲,防止正常的修复程序发生,”他称。

    他将CRISPR-Cas9基因编辑形容为切割与DNA修复之间的一场竞争:一旦Cas9切割,细胞正好取代切割的DNA,Cas9再次切割该细胞,切割与修复无限循环,直到修复酶出现错误,最终该基因失去作用。也许,他说,寡核苷酸降低了修复过程的保真度,或者令细胞转变为一种更容易出错的修复模式,令Cas9更容易破坏基因。

    下一个前沿领域,他表示,将是试图利用DNA修复的特点改善序列插入,从而用一个正常的基因取代有缺陷的基因,以及有可能治愈遗传性疾病。

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