如今全球10大畅销药大部分都是利用哺乳动物与微生物细胞进行生产，利用细胞制造生物药与疫苗当前已在行业中非常普遍。现在一旦出现一个比较著名的，而且不断在扩大的新型生物制品产品线⁽¹⁾ ，它便要面临着与日俱增的成本降低以及和生物仿制药竞争的双重压力，这就意味着许多的生物制药公司需要努力寻找新的方法来提高研发实验室的工作效率，以确保上游工艺的效率和稳定性。

对这些公司而言，其中一个主要挑战是将细胞培养生产工艺高昂成本降低，以确保相关产品用于治疗的商业可行性。例如，抗体治疗中需要使用大剂量(6~12g)单克隆抗体(MAb)来获得临床疗效，这意味着患者每年需要花费数万美元用于此类治疗。目前，使用贝伐单抗和西妥昔单抗治疗大肠癌，每个疗程(8周)⁽²⁾需要花费2~3万美元，是同类小分子疗法的60倍之多。
 

 图1 全自动ambr 250生物反应器应用于发酵和细胞培养
 

预防性疫苗的生产也极具挑战性，虽然当前此类药物的全球销售额与单抗的相比，还相对较小。生产商需要快速的应对出现的市场需求，提供优质价廉的预防性疫苗，既能够应对季节性流感，又能够应对大面积流行感冒威胁。成本和时间限制促使生物制药公司急切需求能够进行快速开发优化并放大生产工艺的策略。
 

越来越扁平化的收入和高开发成本使得产品上市时间对于公司的盈利能力来说至关重要。因此，尽早生产出具有理想品质的产品是所有制药企业的迫切所需。所以对于生物制药而言，快速、高效的工艺开发是成功商业化生产的关键环节⁽³⁾。
 

表1 2

对于生物制品生产企业而言，挑战之一便是大量新法规要求的不断推出。在一种药物或疫苗成功上市之前，生产商必须要证明他们的产品符合所有有关高品质、安全性以及有效性的法规要求。部分法规是为了支持监管义务，而要求提供工艺开发过程中获得坚实的科学证据。因此，在工艺开发和优化过程中，有必要进行多变量分析与实验设计，开展大量的工艺研究实验，而这个过程耗时昂贵且需要大量人力。
 

传统的疫苗生产方法，如摇瓶、台式生物反应器或转瓶均已被应用于工艺开发。但是这些方法需要大量人力，容易出现人为错误。并且需要大面积的实验室和较高的成本。
 

一个清晰易于理解的生物药生产工艺最好是通过应用复合的DoE(实验设计)方法开发出来的。这样的方法具有非常高的试验容量⁽⁴⁾。但应用此类方法必须要对与工艺全面了解，包括培养基成份和所有工艺参数(以及更改参数后所造成的影响)等，因为这些参数不仅会改变产品效价，还将改变产品的质量属性。
 

由于传统工艺开发方法与生俱来的限制，开发过程中包含了大量需要反复实验才能发现的错误，导致许多生物工艺的开发成本不断攀升，让人望而却步。
 

稳定并快速的工艺开发过程只有在一个兼容一次性技术且易于搭建的平行放大平台上进行自动化操作才可实现。因此，有必要摒弃传统的生物工艺开发方法，转而利用全新高通量工艺开发和优化平台。该类型的技术平台应该具备以下三个主要特点：
 

• 小型化，以低成本快速获得海量实验数据;

• 自动化，以进行大量的重复性精准操作;

• 并行性，以更广的评价实验设计域(条件)，加深对工艺细节的理解。

此文中展示了一项自动化的微型生物反应器技术，该技术能够进行微生物发酵和细胞培养的高通量工艺开发和优化。此外，本研究还将通过分析分别收集于自动化生物反应器、实验室生物反应器和中试生物反应器的数据进行对比分析，来展示这项技术的适用性。
 

材料与方法

微型生物反应器：选择用于放大比较的微型生物反应器系统：ambr 250自动化生物反应器(来自TAP生物系统公司，赛多利斯集团成员之一)。该系统由三部分组成：易于连接的250mL生物反应器(有微生物和哺乳动物两种配置可供选择)，自动化工作站和软件(图1。
 

该平台提供更大的培养体积(相对于Ambr15而言)，连续的料液泵送，及每个反应罐的参数独立控制功能。这些特征使得系统能够提供更频繁的补料和供更广泛分析测试的大体积取样。培养条件与流加补料并行调控参数的结合使得Ambr 250成为一款能够支持质量源于设计(QbD)理念的比例缩小反应器模型。
 

Ambr 250工作站属于典型的Ⅱ级(层流式)生物安全柜，设计安装12或24个生物反应器。两款的配置均包括一个自动液体单元，用于生物反应器、样品床或培养基瓶之间的液体传输，还可用于自动取样，接种甚至是培养基制备。
 

概念验证

微生物细胞生产工艺的放大：为了证明ambr 250系统应用于微生物培养工艺开发和比例缩小反应器模型的有效性，需要对分别在微型生物反应器，台式发酵罐以及中试规模的发酵罐中的获得的结果进行对比分析。为此，选择重组表达治疗功效蛋白的大肠杆菌作为模型生物。
 

将克隆细胞培养于ambr 250系统中，该系统使用具有双档20mm直径拉什顿叶轮搅拌的一次性生物反应器。对照实验中分别用15L台式发酵罐和150L中试规模发酵罐培养相同的克隆菌株。

表3 4

所有容器中均按照2-5%的比例接种OD 600值在1和5之间的种子液。采用合成培养基，37℃培养72小时，pH条件控制为7.0±0.03，溶氧(DO)控制为30%，搅拌输入功率为5.33x102至1.43x104 W/ m3。每12小时取样分析一次，使用SpectraMAX plus 384分光光度计(来自Molecular Devices)测量细胞的OD 600值。

在台式和中试发酵罐中，二氧化碳释放速率(CER)采用Prima PRO过程质谱仪(来自Thermo Scientific)进行测定。在ambr 250系统中，通过内置的尾气分析仪测定CER，每一台生物反应器都有独立的尾气分析仪。
 

哺乳动物细胞生产工艺的放大：对于哺乳动物细胞培养而言，为了证明ambr 250生物反应器系统是一款适合的早期工艺开发模型，必须要将其培养结果与台式生物反应器的培养结果进行对比分析。为了说明这一点，选择重组表达治疗功效蛋白的CHO细胞作为模型生物。将细胞分别培养于一次性的ambr250反应器和3-L台式生物反应器中。采用专利的合成培养基， 37℃培养16天，pH控制条件为7.0±0.3，溶氧(DO)控制条件为40%，搅拌叶尖转速为0.25m/s。初始细胞以1x106个活细胞/ mL的密度接种，每24小时取样一次，用ViCell细胞活力分析仪(来自Beckman Coulter公司)进行样品分析。从接种第2天起每间隔24小时检测滴度，使用Biacore400分析仪(来自GE Healthcare公司)进行测定。
 

图2  全自动ambr 250生物反应器最多可控制24个250mL的生物反应器实验
 

小结

可放大性：大肠杆菌菌株在ambr 250生物反应器和15L及150L发酵罐中培养后的细胞密度和二氧化碳释放速率(CER)值表现出非常相似的结果(图1和图2)，15L和150L容器的OD 600值分别在ambr 250数据的两端，CER峰则出现在同一个时间点。这些结果表明，ambr 250系统是一套适用于工艺开发与优化的比例缩小反应器模型。
 

CHO细胞在ambr 250系统和3L生物反应器中所展现的细胞生长能力与产物滴度水平均显示出良好的可比性(图3和图4)，比如最大细胞活力，细胞密度以及产物最高效价在同一时间点达到。而且ambr 250系统比台式生物反应器具有更好的结果一致性。这表明利用ambr 250生物反应器系统开发哺乳动物细胞培养生产工艺具有良好的可重复性。
 

本研究中我们提出了一种并行的自动搅拌式微型生物反应器技术，可以用于微生物和哺乳动物细胞培养工艺的快速开发优化。结果表明， ambr 250生物反应器系统可以复现更大规模反应器(实验室和中试规模)中哺乳动物和微生物培养工艺，并获得一致的结果(细胞密度和效价)。这与已发表的CHO细胞培养工艺开发数据一致，表明自动化微型生物反应器可以模拟台式生物反应器(5,6)，并且在关键参数(如细胞生长和效价)上，两者具有高度可比性。
 

Ambr 250 生物反应器系统可以自动并行操作多达24个生物反应器，所以DoE实验可以在一轮实验中完成。这意味着多参数变量的研究不再受限于台式生物反应器数量、操作时间和设备状态等多方面因素。Ambr 250生物反应器系统可以替代摇瓶和传统的台式生物反应器模型用于工艺开发和优化。这将减少人工操作强度，从而极大地节省了时间，减少实验室配套设施，并且降低培养基的消耗。
 

该平台自动化程度高，易于建立，且耗材一次性使用，减少了辅助时间，细胞培养体积也小，因此科学家可以利用它专注于设计并执行高通量实验，快速获取准确的数据。Ambr250系统可以帮助开发者显著减少重复实验次数，节省时间，是生物制药工艺开发与优化高效并经济的工具。

应用ambr 250生物反应器系统还能提高实验数据质量，将复杂的统计实验设计与分析应用于哺乳动物与微生物细胞工艺开发中。这将显著缩短早期开发时间并降低开发成本，缩短技术转让与产品上市时间，最终得以向市场提供更加廉价的生物药物和疫苗。
 

参考文献：

1 Biot J, et al. From Orthoclone to Denosumab, the Fast-Growing Market of Monoclonal Antibodies. Med. Sci. 25(12) 2009: 1177–1182.

2 Cornes P. The Economic Pressures for Biosimilar Drug Use in Cancer Medicine. Target Oncol. 7(supplement 1) 2012: 57–67.

3 Rahul B, et al. High-Throughput Process Development for Biopharmaceutical Drug Substances. Trends Biotechnol. 29(3) 2011: 127–135.

4 Bareither R, et al. Automated Disposable Small-Scale Reactor for High-Throughput Bioprocess Development: A Proof of Concept Study. Biotechnol. Bioeng. 110(12) 2013: 3126–3138.

5 Hsu WT, et al. Advanced Microscale Bioreactor System: A Representative Scale-Down Model for Bench-Top Bioreactors. Cytotechnology 64(6) 2012: 667–678.

6 Lewis G, et al. Novel Automated Micro-Scale Bioreactor Technology: A Qualitative and Quantitative Mimic for Early Process Development. BioProcess J. 9(1) 2010: 22–25.