就在不久前的7月，FDA颁布了指南《Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics》的终稿文件，这份关键的指南文件，为制药行业的分析方法验证提供了技术指导。本文作者为了让大家更好的理解和掌握此指南，根据工作经验，解读如下，一起来看下具体详情。

　　分析方法验证一直是药品研发和质量控制的关键问题，也是重点问题，一直被制药行业所关注。在2015年7月份之前，世界各国法规方颁布了一系列的相关指南或者指导原则：

　　---中国CDE颁布的《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》；

　　---2015版药典附录XIX A《药品质量标准分析方法验证指导原则》；

　　---ICH Q2《VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY》；

　　---FDA指南《Analytical Procedures and Methods 17 Validation》

　　---FDA指南《Guidelines for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation》。

　　在2015年7月，FDA颁布了指南《Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics》的终稿文件，这份关键的指南文件，为制药行业的分析方法验证提供了技术指导。为了让大家更好的理解和掌握此指南，笔者根据工作经验，解读如下。

　　这部指南介绍了很多内容，包括起草背景、法规要求、分析方法的研发、分析方法的内容要求、标准品和试剂的要求、分析方法验证的要求、统计分析和模型、分析方法的生命周期管理、方法确认的内容。本文选择关键点，为各位介绍这份指南的技术要求。

　　第一部分：分析方法研发的要求

　　在方法研发的早期，应对方法的耐用性进行评估和研究，因为该属性可以帮助申请者决定提交哪个方法去获得批准。研发早期的分析方法是基于对基础方法学的了解和之前的经验来建立的。早期程序的实验数据可以用于指导进一步的研发。如果这些研发数据支持分析方法的验证的话，申请者应该在方法验证部分提交相关的研发数据。

　　为了全面了解分析方法参数变更的影响，申请者应该采用一个系统的方法进行方法耐用性研究（例如设计一个方法参数实验）。开始申请者应采用风险评估，然后进行多变量实验。这样的方法能让申请者了解参数因子对方法性能的影响。对方法性能评估可以包括分析来自生产工艺中的中控阶段到成品阶段的样品。从这些方法变化来源的研究中获得的知识可以帮助申请者评估方法的性能。

　　第二部分：分析方法的内容要求

　　在这部分，FDA指南展开介绍了很多内容，依次如下：

　　2.1原理/范围

　　需要描述分析测试方法/技术（即分离、检测）基本原理的情况。还要描述目标分析物和样品类型（例如原料药、制剂、杂质或生物液体中的化合物）。

　　2.2仪器/设备

　　在这部分需要描述所有需要的确认过的仪器和组件（例如仪器类型、检测器、柱子类型、尺寸和可替代的柱子、过滤器类型）。

　　2.3运行参数

　　需要提供确认过的优化的参数设置和范围（包括来自药典或研发和/或验证研究的允许调整），对于分析过程非常关键（例如流速、部件温度、运行时间、检测器设置、梯度、顶空进样器）。适当时，可以使用经验参数设置和积分参数的样图来作为补充。

　　2.4试剂

　　在这部分需要提供：

　   ---试剂或标准的描述

　   ---化学品的级别（例如，USP/NF，美国化学协会，HPLC色谱级，或GC色谱级或无防腐剂的）

　   ---来源（例如USP标准品，内部确认的对照物质，WHO国际标准/对照物质，CBER标准）

　   ---纯度（只有纯的化学品需要）、状态（例如干品，未干燥品）和浓度

　   ---效价（CFR，USP所要求）

　   ---存贮条件

　   ---安全使用指示（以现行MSDS为准）

　   ---验证过的或书面确认的货架储存期

　　---生物试剂的新批号，例如，单克隆抗体、多克隆抗原、或细胞，可能需要包括进一步确认程序，作为分析方法的一部分。

　　2.5样品制备

　　各供试样品的制备程序（例如提取方法、稀释或浓缩、除盐和超声混合、震摇或超声时间）。供试样定性单样配制方法，定量测试平行样品配制方法，工作溶液适当的浓度单位（例如μg/ml或mg/ml），以及溶液的稳定性和存贮条件的信息。

　　2.6标准控制溶液制备

　　所有标准溶液和控制溶液的制备和使用程序。需要注明适当的浓度单位，有标准稳定性信息和存贮条件，包括校正标准、内部标准、系统适用性标准等。

　　2.7检验程序

　　对方法的逐步描述（例如平衡时间，扫描/进针序列，空白，基底样，样品，控制样，敏感溶液（杂质方法）和在分析过程中维持系统适用有效性的标准样）以及允许运行范围和适当时的调整。

　　2.8系统适应性

　　对测试程序和参数进行确证以保证系统（仪器、数据工作站和分析操作要点和分析的控制点）能在使用时作为一个整体正确运行。适用于对照控制和样品的系统适用性的可接受标准，如拖尾因子、精密度和分辨率可接受标准，在适当时可以进行要求。色谱系统的系统适用性，参见FDA行业指南《色谱方法的验证》和USP通论<621>色谱。

　　2.9计算

　　根据标识声明和质量标准（例如含量、特定和非特定杂质和相对响应因子）进行测试所得的数据分析（标准、控制、样品）中所用的积分方法和代表性计算公式。其中应包括数据分析中所使用的所有数学变换或公式的描述，以及使用的所有修正因子的科学论证。

　　2.10数据的报告

　　与仪器的能力和可接受标准相一致的数字式数据的表现方式。方法中应指明要采用何种格式来报告结果（例如标识声明的百分比，重量/重量，重量/体积），并指定所需报告的有效位数。美国材料试验协会（ASTM）E29标准中描述了在测试数据中使用有效位数来决定与质量标准符合性的标准规范。如果是色谱方法，申请者应该包括保留时间（RT）用于与标准品比较，相对保留时间（RRT）（已知和未知杂质）可接受范围和样品结果报告标准。

　　第三部分：标准品和试剂的要求

　　基准标准品和二级标准品和物质在ICH指南中已有定义和讨论：Q6B《质量标准：生物技术/生物制品检验方法和可接受标准》和Q7《原料药GMP指南》。申请者要确保所有的标准品均适合于其目的用途。申请者要严格遵守标准品存贮和使用条件及处理指令，避免改动和污染，这可能会导致另外的杂质和分析不准确。申请者应该在申报资料中包括各标准品和物质适合于其用途的支持信息。适当时，支持标准品和物质的信息应包括确认试验报告和检验报告（包括稳定性试验方案、报告、相关已知杂质概况资料）。对于BLA下的生物制品，要在年报中包括之后的标准品批次的确认。

　　标准品通常可以从USP处获得，也可以通过EP、JP、WHO或国际标准技术委员会获得。大量的生物产品标准品也可以从CBER处获得。在美国上市的特定生物制品，CBER授权的标准品必须在产品放行上市前使用。从其它来源获得的对照物质应根据程序进行确证，包括常规测试和ICH Q6B里所述的超出常规放行测试的项目。申请者应考虑矩阵方法来确证标准品。附加测试可以包括确定标准品的适用性，这可能在原料药或药品放行测试中发现不了（例如更全面的结构确证和效价、纯度和杂质矩阵技术）。

　　新的标准品（官方的或自制的）要采用现行的标准品进行确认/校正。对于生物制品标准品和物质，FDA建议申请者在确认新的标准品时采用双轨方法，以防止质量属性的漂移。双轨方法是将每个新的标准品与基准标准品进行比较，这样将其与临床试验物质和现行生产工艺相关联。

　　第四部分：分析方法验证的要求

　　4.1非药典分析方法

　　分析方法验证是证明一个分析方法适合于其既定用途的过程。方法学和分析方法的目的应在开始验证研究之前进行清楚的界定和了解。这种了解是来自于基于科学的方法研发和优化研究。验证数据必须是从申请者按GMP规范批准的方案中产生，方案中要有每个验证项目的方法学描述，并确定和论述可接受标准，采用经过确认的仪器实施验证。应起草并实施原料药和制剂分析物或对应基质的分析混合物的验证方案。申请者应该在申报资料中包括验证研究及结果的详细内容。

　　4.2验证属性项目

　　尽管并不是所有的验证属性适用于所有类型的测试，但一般的验证属性包括：

　　Specificity 专属性

　　Linearity 线性

　　Accuracy 准确度

　　Precision (repeatability, intermediate precision, and reproducibility) 精密度（重复性、中间精密度和再现性）

　　Range 范围

　　Quantitation limit 定量限

　　Detection limit 检出限

　　如果一个方法是经过验证的定量分析方法，可以检出原料药和制剂在存贮期间的质量属性的变化，则认为该方法是具有稳定性指示性的测试方法。为了证明一个稳定性指示检验方法的专属性，要进行一系列的挑战。一些挑战包括向样品中加入目标分析物和所有已知的干扰物、经过不同化验室强降解试验的样品、实际药品的样品（通过最终生产工艺生产出）经过长期放置或在加速温湿度条件下存贮。

　　4.3药典分析方法

　　一个分析方法（例如USP/NF，AOAC国际的官方分析方法，或其它公认的标准对照）的适用性应在实际使用条件下经过确认。证明USP/NF分析方法适用于原料药或制剂的资料应包括在申报资料里，并且是从确认方案中产生的。

　　确认方案应包括，但不仅限于（1）要确认的药典方法，预定的可接受标准，（2）方法学的详细说明（例如试剂、设备、配件、色谱条件、色谱柱、检测器类型、检测器信号响应灵敏度、系统适用性、样品制备和其稳定性）。该方法和确认程度应决定要包括在方案中的验证项目测试（例如专属性、LOD、LOQ、精密度、准确度）。在决定方案中应包括哪些验证项目时的考虑取决于一些具体情况，如质量标准限度设定是否严于药典可接受标准，或RT或RRT概况由于原料药合成路线、生产工艺或制剂基底不同而在色谱方法中有所变化。如果完全按照药典方法实施，没有偏差的话，药典含量方法不需要进行耐用性研究。

　　第五部分：分析方法生命周期内的管理

　　分析方法（包括药典方法）被成功验证（或确认）和实施后，在其产品的生命周期中应遵守该方法，以持续保证方法保持适合其既定用途。应定期对方法表现进行趋势分析，评估是否需要对分析方法进行优化，或对全面或部分分析方法进行再验证。如果一个分析方法只能通过不断调整分析方法里载明的运行参数来符合所建立的系统适用性要求，则应对该分析方法进行再评估、再验证，适当时进行修正。

　　在一个产品的整个生命周期中，新的资料和风险评估（例如对产品CQA有更好的了解，或发现新的杂质）可能会保证一个新的或替代的分析方法的研发和验证。新技术可能会带来产品质量保证方面更多的了解和/或可信度。申报者应定期评估产品分析方法的适当性，考虑新的或可替代的方法。

　　预计在生命周期中会对分析方法进行变更，因此要保留适当数据量的留样进行对比研究。样品数量应基于科学原理以及风险评估。对生产工艺较为敏感的复杂产品，其留样可能是做对比研究的重要工具。

　　用于对比研究的留样应包括代表上市药品的样品，如可能，还应包括关键的临床试验物料。

　　如果基于风险的评估或其它原因导致对分析方法进行变更，或采取新的方法取代旧的方法，或分析方法转移至一个新的检测场所，则要考虑进行再验证、新的验证、分析方法对比研究或联合进行这些工作。在有些情形下，对原料药或药品生产工艺的变更也会导致分析方法再验证。这些额外的研究讨论如下：

　　5.1再验证

　　在前面分析方法验证部分所述原则适用于再验证。如果对一个分析方法进行了变更（例如对设备有变更，或试剂的变更，或因为生产工艺或配方有变更），则可能要考虑对分析方法进行全部或部分再验证。在和平工艺变更时可能也需要对分析方法进行再验证，例如可能影响分析方法性能的原料药生产工艺变更（例如合成路线、发酵）或引入新的制剂配方。

　　申请者要进行再验证以保证分析方法维持其关键性能指标（例如专属性、精密度、准确性）。再验证的程度取决于变更的性质。

　　5.2分析方法对比研究

　　分析方法对比研究要求一般是在申请者提议采用一个替代分析方法取代一个FDA批准的分析方法时，或将一个分析方法从一个实验室转移至另一个实验室时产生的。用于决定两个分析方法的等同性的统计学方法信息，需要引用适当的文献或文件。这些情况讨论如下：

　　5.2.1可替代的分析方法

　　替代性分析方法是申请者用来代替FDA已经批准的分析方法的一种分析方法。对于一个NDA或ANDA，申请者要将所有拟定的替代分析方法包括在申报资料中。申请者必须包括方法描述。在批准后，对于一个NDA或ANDA，或在BLA里批准但未包括在FDA法规里的分析方法，凡增加、修改或删除替代分析方法均要在下一次年报中记载。

　　对于生物制品，FDA法规里可能很少包括分析方法。如果所需的分析方法在法规里进行了描述，但申请者想使用一个方法来替代，申请者必须根据21 CFR 610.9(a)提交替代方法供审核和批准。申请者必须提交证据"……证明方法修订能确保生物制品的安全、纯度、效价和有效性等同或优于生物制品通用标准或附加标准中给出的方法或程序"。对这样程序的修订需要在申报资料评估过程中或在批准后增补中获得FDA批准。

　　申请者要分辨可替代性分析方法的使用（例如放行检测、稳定性测试），提供其内容的合理性论证、验证数据和与FDA批准的分析方法的对比数据。申请者要进行分析方法对比研究，至少证明：

　　---新的方法配备了另外的控制手段，在其既定用途上等同或超过原始方法

　　---新的分析方法比原始方法更不易受到基质的影响

　　如果采用新的检验方法能发同新的与工艺杂质或产品变化产生的杂质或所有新的杂质，则应对历史批准的留样进行检查，证实新方法检出的变化/杂质是因为新的方法灵敏度或选择性增加的结果，而不是工艺杂质变化的结果。

　　如果分析方法具有稳定性指示特性：

　　---应包括适当的样品，比较新的方法和原始方法检出相关产品变化和降解物的能力；

　　---对比时所分析的批次数应能提供足够的统计性能；

　　---要采用适当的统计学方法来实施等同性、不低于或优越性研究，来证明新方法或修订过的方法的性能等同或优于原始方法；

　　---要识别出用于比较产品检测结果的统计学分析方法；

　　---适当时，分析方法间所有观察到的偏差或差异以及对比结果均应进行讨论，并提出解释。

　　5.2.2分析方法转移研究

　　分析方法转移一般要使用转移方案进行管理，在方案中详细写明要评估的参数，以及适用于结果的预定可接受标准。转移研究通常包括两个或更多化验室或场所（转出化验室和接收化验室），由其实施预先批准的转移方案。转出化验室和接收化验室使用具有代表性的足够数量的测试物（例如相同批号的原料药或制剂）。实施对比研究是为了评估准确度和精密度，特别是实验室之间的差异。如果所转移的分析方法也是稳定性指示性方法，则应在两个化验室均对强降解样品或含有所要检测的相关杂质的样品进行检测。USP通论<1224>"分析方法转移"提供了关于此问题的更多指南。

　　综述

　　从上面的介绍来看，FDA最新分析方法验证指南具有如下特点：

　　第一、 更重视方法开发的作用。根据QBD的理念，好的分析方法一定是开发出来的，而不仅仅是验证的结果。

　　第二、 分析方法的描述必须全面，在指南的分析方法内容要求部分，详细介绍了分析方法应该含有的技术内容。这和国内很多企业分析规程只包括项目和限度的做法，是明显不同的。一个只包括项目和限度的分析规程，是不完整的，不能体现分析方法的全貌。

　　第三、 分析方法必须实施生命周期内的管理，如果出现各类变更，应该及时进行再验证。

　　第四、 FDA介绍了分析方法对比的要求的分析方法转移的要求，这都是国内指导原则的不足之处，可以起到补充作用。

　　作者简介：zhulikou431，高级工程师、PDA会员、ISPE会员、ECA会员、PQRI会员、资深无菌GMP专家，在无菌工艺开发和验证、药品研发和注册、CTD文件撰写和审核、法规审计、国际认证、国际注册、质量体系建设与维护领域，以及无菌检验、环境监控等领域皆具有较深造诣。近几年开始着力关注制药宏观领域趋势分析和并购项目的风险管理工作。