FMD对运动协调、记忆和神经生成的影响

衰老伴随着运动和认知功能的下降（Lynch,2004）。为了评估运动协调和平衡，我们测试了小鼠对加速旋转的表现（Shiotsuki等，2010）。23月龄小鼠，每2周中有1周实施FMD（FMD-RF，FMD测试1周后，恢复正常日粮粮饲喂），在旋转轮上比对照组小鼠停留的时间更久（图3A）。我们还在随后试验期间，通过检查性能的改善，对运动学习能力作了评估。FMD-RF组小鼠，一直比自由采食日粮组小鼠更好地停留在加速杆上面，虽然两组的学习速度是相似的（测试2-5；图3B）。小鼠的体重与最佳旋转表现是呈负相关的（皮尔逊相关系数r=-0.46；P=0.005）。当体重恰当时，旋转表现的改善不再显著（P=0.34，数据未列），这表明FMD小鼠得益于减肥。

为了检测禁食模拟日粮（FMD）对认知功能的影响，我们对23月龄小鼠进行了记忆测试（Beninger等，1986）（图3C）。FMD组小鼠与对照组小鼠相比，增强了自发交替改变行为的情况，但其前肢伸进容器的总次数没有差异（活动性测定）（图S3A）。使用新目标测试，来评估短期认知功能和程序依赖性记忆（图3D和3E）（bernabeu等，1995）。FMD小鼠（RI=0.06）与对照组小鼠（RI=0.52）相比，有较高的识别指数（P﹤0.01，图3D）。FMD小鼠对新目标的探索时间有所增加，然而，总的探索时间保持相同（FMD-RF 13.4±0.9对CTRL 13.6±0.9），这表明短期认知功能增强，而总的活动性没有增强（图3E；图S3B）。

作为衡量长期记忆的方法，我们使用巴恩斯迷宫来测量小鼠的空间学习和记忆能力：一种海马相关性认知任务，需要通过对视觉线索的学习和记忆的空间参照系记忆，来定位独特的逃逸箱路径（图3F-3K）（Barnes,1988）。7天训练期间，FMD组小鼠在有关错误、偏差、等待和成功率方面，优于对照组（图3F-3I）。在第14天，测试小鼠的记忆保持情况，FMD组表现了更好的记忆力，表明其记忆偏差减少。对照日粮组小鼠的记忆偏差，在14天时相似于第1天，表明这些小鼠经过7天的学习，仍未能记住逃逸箱的定位。观察到了FMD组小鼠搜索策略的转变，包括在空间策略方面，从随机到连续搜索的转变，但对照日粮组在3-4天以后仍未有改进。总之，行为测试表明，周期性FMD改善了老年小鼠的运动学习以及海马相关的短期和长期的记忆。

成年时的神经生成，在学习和记忆中起着重要的作用（Clelland等，2009；Deng等，2010；Mattson,2012）。为了确定模拟节食日粮是否影响神经生成，我们测定了8周龄、12周龄、6月龄和24月龄对照组小鼠的颗粒细胞下层中溴脱氧尿苷（BrdU）的掺入（图4B）。与之前的报道相似，我们观察到BrdU在齿状回中的掺入，有一个年龄相关性下降（Lee等，2012c）（图4B）。为了评估FMD组的认知改善是否与神经再生有关，我们测定了海马齿状回颗粒细胞下层中的DCX+未成熟神经元的增殖指数。BrdU+或BrdU+DCX+双标记表明，FMD组中未成熟神经元的增殖，比对照组有了增加（图4C-4E）。为了研究FMD诱导新神经生成的机制，饲喂的6月龄小鼠与FMD单次的8周龄小鼠相比，齿状回的细胞增殖减少了50%以上（图4B）。FMD72小时以后，我们观察到循环中的和海马中的IGF-1（图4F）减少，不过，海马体齿状回区中IGF-1受体mRNA则增加了(图4G)。FMD小鼠充实的齿状回样本的微解剖，显示蛋白激酶A（PKA）活性大幅降低和Neuro D1表达具有2倍的诱导力（图4I），Neuro D1是一个对神经的保护和分化有重要作用的转录因子（Gao等，2009）。同样，一个周期的FMD增加了CD-1小鼠的放射状胶质细胞（Ⅰ型）、非放射状前体（Ⅱ型）神经干细胞（图S4B，S4C，S4F和S4G）、未成熟神经元（图S4D和S4I-S4Q）和树突状覆盖区（图S4E和S4H）。

在两个遗传背景中的这些结果，表明FMD促进了成年小鼠的神经生成。值得注意的是，FMD期间大脑没有经历可以测量到的重量减少，表明在恢复饲喂后，神经的再生也不依赖于器官体积的增加而独立地发生。因此，我们假设，恢复饲喂以后，循环因子例如IGF-1水平和PKA信号降低的改变，可诱导有利于再生的变化，依赖性地或独立性地发生主要细胞的增殖，这与先前在骨髓和血液细胞中的发现是相一致的（Cheng等，2014）。最有可能的是，再饲喂后，IGF-1和PKA的增加，也有助于增殖和再生，这些蛋白的高水平和低水平二者可促进再生可能性的提高，这取决于它们表达的时间。或者，FMD可能提高了新分化神经元的存活，如在恢复饲喂日小鼠齿状回中所观察到的（Lee等，2002；Mattson 等，2001）。于FMD组中观察到的认知能力的改善，可能是受到依赖于Neuro D1调节的PKA/CREB（环磷腺苷效应元件结合蛋白）的影响（Cho等；Sharma等，1999），这被认为提高了海马祖细胞神经元的存活和分化（Roybon等，2009），提高了新神经元的功能集成和减轻了阿尔茨海默氏病小鼠模型的记忆缺陷程度（Richetin等，2015）。

FMD和寿命

对照组小鼠的平均寿命为25.5个月（图5A），FMD组小鼠的寿命延长到28.3个月（延长了11%）（P﹤0.01）。FMD组小鼠在75%生存点时，寿命的延长效应达18%，但在25%生存点时的延长作用只有7.6%，而在最长寿命点时则没有效果，这表明在很老年龄段时，4天的FMD可能在某些方面是有益的，而在其他方面是有害的。进一步的分析表明，很老年龄段许多小鼠的死亡，发生在FMD周期完成时或完成后的短时间内（3天内）（图5E；用星号标出的）。这些结果表明，周期性FMD对寿命和一生的影响，至少对非常老的小鼠，一个较少严格（3天对4天）低能量和低蛋白的日粮，可能会更好地提供有益的作用，而把营养不良降到最低程度，这与我们最近在小鼠和中老年及很老的人中的研究证明，摄入高蛋白对健康/死亡率，会起相反作用的结果是相一致的（Levine等，2014）。

周期性FMD先导随机临床试验

衰老和疾病的标志物

为了评估周期性低蛋白和低能量FMD对人体的可行性和潜在的影响，我们进行了一项普通健康成年人的先导临床试验。人FMD中的主要和微量的营养组分和水平，是根据它们在小鼠FMD中，降低IGF-1提升IGFBP-1、降低血糖提升酮体、使营养分尽可能达到最大值、和使不良影响降到最小值（图S1）的作用来选择的。人类FMD的配制，需考虑其可用性（如人对规定的饮食方案，具有高度的可遵循性），因此，设计了每个月持续5天的，由9%-10%蛋白质、34%-47%碳水化合物和44%-56%脂肪组成，可提供34%-54%常规摄入能量的FMD。连续地进行3个月的试验。受试者被随机地分配到FMD组或对照组。对照组，仍保持他们原来的正常饮食。FMD组，在FMD时期后，重新食用他们正常的日粮，并请他们对正常的饮食和锻炼习惯不要有任何的改变。5%的受试者，由于未能遵循试验的饮食方案，而从试验中剔除。14%的受试者，由于非FMD相关的原因，而退出了研究（如工作和旅行相关程序的安排问题）。我们提交的这个先导随机临床试验结果，包括一组成功完成3轮FMD的19个受试者，和19个随机对照受试者保持他们正常饮食的数据。对照组包括9名女性（47.4%）和10名男性（52.6%），平均年龄分别为35.4±5.5岁和38.0±1.7岁。FMD组包括7名女性（36.8%）和12名男性（63.2%），平均年龄分别为41.8±4.9岁和42.5±3.5岁（图S5A和S5B）。对照组的年龄幅度19.8-67.6岁，FMD组的年龄幅度27.6-70岁。受试者的种族分别为白人58%、西班牙裔18.5%、亚裔18.5%和黑人5%（图S5C）。受试者通过基础检查来进行评估（图6A）。FMD组在第一轮FMD结束和重新食用正常食物之前随机进行检查，以及在5-8天正常饮食之后再接着进行第3轮FMD之间实施检查（FMD-RF，图6A）。基础检查和FMD-RF检查之间/测定点的平均时间为75.2±2.7天，而对照组的基线检查和最后检查之间的测定点平均时间为74.5±6天。对所有3个FMD周期中的受试者，根据副反应的常用标准术语，由他们自己报告副反应情况（图S5D）。首轮FMD完成后，比那些第2和第3轮FMD期间的副反应更高。然而，报告的平均副反应严重性是非常的低，在“轻度”以下（以1-5级计，﹤1级）。

FMD受试者中，在重新食用正常日粮后，接着进入第3个FMD周期之间，测定的空腹血糖水平比基线水平降低了11.3%±2.3%（P﹤0.001；FMD），维持在5.9%±2.1%（P﹤0.05；图6B）。血清酮体在FMD养生法结束时增加了3.7倍（P﹤0.001），正常进食后则恢复到基线水平（图6C）。循环IGF-1在FMD时结束降低～24%（P﹤0.001），在恢复正常饮食后仍保持降低～15%（P﹤0.01；图6D）。IGFBP（鼠胰岛素生长因子结合蛋白）在FMD方案结束时增加了1.5倍（P﹤0.01），而在正常进食后则恢复到基线水平（图6E）。这些结果表明，FMD组小鼠有高度的依从性，除了在FMD日粮箱供给它们时，一般地不会采食。

体重、腹脂、去脂体重和代谢标志物

  FMD降低了小鼠的体重和减少了内脏脂肪。我们通过测定小鼠体重、腹脂和去脂体重，来研究FMD是否能够在人体中也有类似的作用。FMD导致了体重减少3%（3.1%﹤±0.3%；P﹤0.001；图6F），到完成研究时，体重仍保持在较低的水平（P﹤0.01；图6F）。用双能X线吸光测定法测定，躯体脂肪的百分比，在3轮FMD和正常进食1周后，呈现下降趋势（P=0.1）（图6G），而在3轮FMD完成后，经与体重校正过的相对去脂体重则增加了，这表明体重损失的大部分是脂肪。FMD对骨盆骨的矿物质密度没有影响（图S5D）。

一组完整代谢数据（图S5E-S5L）表明，在恢复正常日粮后，除了胆红素和碱性磷酸酶含量较低外，没有因FMD而存在持久的代谢改变。总之，据受试者自己报告的常见标准术语副反应事件，提供的这些最初的证据表明，周期性FMD总的来说是安全的，只引起脂肪的减少，而不减少去脂体重。

心血管病风险因子

FMD减少了小鼠中与炎症有关疾病的发生（图2）。人体中血清C反应蛋白（CRP）的水平，是一个炎症和心血管疾病风险因子的标志物。FMD受试者的CRP平均基线水平是1.45±0.45mg/L(图 6I),类似于对照组水平（1.29±0.5mg/L）,这表明存在着一个平均的心血管疾病轻度风险。通过周期性FMD，降低了CRP水平。19个FMD受试者中的8个，CRP水平在基线之上（分别高于1.0和3.0mg/L），处在中度和高度的心血管疾病风险范围内。19个FMD受试者中的7个，经过3轮FMD后，CRP水平回复到正常范围（低于1.0mg/L）(图6I)。11个FMD受试者的CRP水平低于基线1.0mg/L,在试验完成时观察到CRP浓度没有改变。这些结果表明，周期性FMD促进了抗炎作用和至少降低了一个CVD（心血管疾病）的风险因子。

再生性标志物

周期性FMD小鼠，促进了间充质干细胞和祖细胞的增加（MSPC；图2）。我们因此分析了FMD受试者外周血液中的lin-CD184-MSPCs(图 6J)。随着再度饲喂以后，FMD外周血中的MSPC百分比，回复到基线水平（0.27±0.2），虽然没有显著性，但单核细胞亚群在FMD终点时达到1.06±0.6，显示了比基线水平增加0.15±0.1，呈现了一个增加的趋势（P=0.1）。这将需要有一个较大的随机试验来确定，人体中的特定干细胞亚群的数量，事实上是否由于FMD得到了升高。

简单地说，这项研究表明，周期性FMD的诱导使许多组织，包括小鼠中的内分泌、免疫和神经系统等许多组织和人体疾病及再生组织，获得了益处和/或复壮的效果。虽然，这些临床试验的结果，需要由更大型的随机临床试验来确证，不过，周期性FMD对衰老、癌症、糖尿病和心血管疾病的生物标志物/风险因子的影响，加上受试者对FMD有很高的依从性和安全性，表明这种周期性节食策略，对有效地延长人类的寿命和提高健康水平，是有高度潜能的。因为，持续时间较长的FMDs，例如，本研究中的一个试验是强力和广谱的，所以，它们应该只有在医学监管之下才可使用。

实验材料和方法

受试者

实验设计和报告的准备，遵循CONSORT标准（随机对照临床试验报告规范）。可用的数据取自于已经递交的先导试验。遵循南加州大学伦理审查委员会批准的协议，根据其规定的标准，包括（总体健康的成年志愿者，年龄18-70岁，体重指数BMI 18.5及以上）和包括（任何重大疾病和慢性病、精神疾病、药物依赖、激素替代治疗[脱氢表雄酮、雌激素、甲状腺剂、睾酮]、女性的怀孕或哺乳、特殊饮食需求或食物过敏、酒精依赖）等，进行招聘受试者。全部受试者签具知情同意书，而且不向受试者提供经济补偿。受试者在经过基线检查后，基于年龄和性别的统计处理，分配于对照组（CTRL，n=19）和实验日粮组（FMD，n=19）。CTRL组继续食用正常的食物，受试登记后，回家，再跟踪检查3个月。FMD组受试者食用提供的实验日粮连续5天，接着25天食用正常食物，共进行3轮循环。在全部3个FMD循环期间，由受试者按照副反应常用标准术语，报告自己所出现的副反应。FMD组，在第1个FMD周期结束和恢复食用正常食物之前，以及第3个FMD周期结束，接着正常饮食5-8天（FMD-RF）以后，进行各项检查。预先确定结果的测定，包括坚持饮食方案和研究持续期，及完成研究后生理标志物的评估。检查包括身高、连衣体重，使用双能X线吸光测定法（DEXA）测定身体的成分（包括全身脂肪、软瘦肉组织和骨矿物质含量）、以及通过静脉穿剌抽取血液。所有的数据，由南加州大学糖尿病和肥胖症研究所采集。完整的代谢组，由加州大学凯克医学中心临床实验室，在血液抽出后立即测定。数据分析，根据研究设计进行。当研究完成时，完整的数据将可在其他的地方利用。

人的日粮

人的禁食模拟日粮（FMD）方案，是一个植物为基础的日粮方案，设计达到禁食样效果，同时提供微量营养（维生素、矿物质等）食物，并把禁食的折磨降到最小。它的专利组成，以蔬菜为基础的汤、能量条、能量饮料、小片零食、甘菊花茶和一张蔬菜补充配方表（表S4）。人FMD 5天实施方案：第1天的日粮供应能量～1090千卡（10%蛋白质、56%脂肪、34%碳水化合物），第2-5天的日粮由相同成分构成，但只提供725千卡（9蛋白质、44%脂肪、47%碳水化合物）能量。

动物

所有动物方案，均经南加州大学动物管理和使用伦理委员会批准。实验设计和报告准备遵循小鼠工作的ARRIVE（动物研究：体内实验报告）标准执行。110只9月龄雌性C57BI/6（查尔斯河实验室）小鼠，由退休人员饲养于无病原的环境中，放置于清洁的鞋匣样笼子里，每笼3只小鼠，恒温恒湿、，周期性12小时光照12小时黑暗，以及自由饮水。16月龄的小鼠，被随机地以免咬斗而按笼分配到自由采食对照组（CTRL）和禁食模拟日粮组（FMD）。小鼠体重，常规地每两周在开始新FMD周期之前测定一次。每天测定FMD和CTRL各9只小鼠的安全性评估，并记录FMD期间的体重变化情况。测定每天的采食量。小鼠一旦出现进行性皮炎时，即用三联抗生素软膏（富热拉制药公司）治疗，如果病情恶化则予以安乐死。为了减少主观性偏差，在任何实验不久前，小鼠被短期地随机分配（使用Graphpad软件的在线随机数据计算器）到任一行为和生理学的评估中。显示衰弱和/或疾病迹象的小鼠，均不纳入任何实验中。死亡或废弃的小鼠即进行尸体剖检，并把所有异常种类病变递交一位病理学家评估。73只小鼠进行了尸体解剖检查；2只小鼠（每组各1只）因同类相食而未能尸检。我们还用相同的方法，利用品系匹配更年青小鼠，来确认风险因子的年龄相关性变化。此外，6月龄雌性CD-1小鼠（查尔斯实验室）被用于测定成年鼠神经生成的增补实验。

小鼠日粮

小鼠自由采食经幅照过的TD.7912啮齿动物食品（哈伦泰克拉德公司），每克含15.69千焦消化能（3.92KJ/g 动物蛋白质，9.1KJ/g碳水化合物，2.6KJ/g 脂肪）。

FMD经营养成分的检查，确认使其营养成分在试验期间的低能量消耗（Brandhorst等，2013）。FMD设计有两种不同组成成分，按照各自的顺序分为第1天的日粮和第2-4天的日粮。第1天的日粮由混合的多种低能量汤粉、蔬菜混合粉、特级初榨橄榄油和必需脂肪酸组成；第2-4天日粮由低能量汤粉和甘油组成。两种配方日粮用水凝胶（清洁的水）使它们达到粘结，以致可把这种食物放入笼中的饲喂器。第1天的日粮含有7.67KJ/g能量（提供正常日粮摄入能量的50%；0.46KJ/g蛋白质，2.2KJ/g 碳水化合物，5.0KJ/g脂肪）；第2-4天日粮是相同的，含有1.48KJ/g 能量（提供正常日摄入能量的~10%；0.01KJ/g 蛋白质/脂肪，1.47KJ/g 碳水化合物）。另一种FMD是供给3天饲喂，用于成年鼠神经生成评估，含有0.26KJ/g（0.01KJ/g蛋白质/脂肪，0.25KJ/g碳水化合物）。小鼠吃完了FND方案每天提供的食物，却没有表现出对食物有厌恶迹象。任何一种日粮饲喂期结束和在另一个FMD周期之前，供给小鼠自由采食TD.7912食物10天。在FMD之前，把小鼠转换到新笼子里，以避免采食剩余的食物以及形成食粪癖。

生存分析

生存的终点，定义为处理开始日期和死亡日期之间的持续时间。小鼠出现严重应激、健康状况恶化、肿瘤负荷过重，被认为濒死，则处以安乐死。FMD组中有2只小鼠被废弃，1只由于突发头/颈损伤，另1只小鼠于麻醉期间死亡。包括在生存中共有75只小鼠，对照组46只，FMD组29只。12只小鼠由于进行性皮炎而废弃（CTRL9只，FMD3只），在健康和寿命的评估中认定为死亡。2只被同类相食的小鼠，因为其在分析中，认定为是肿瘤以外的原因引起的死亡。二级分析认为2只鼠的死亡，与肿瘤产生的结果是相似的（数据未列出）。

生理标志物

采集测定血糖的血液之前，停止小鼠采食4小时，以免进食对血糖的干扰。使用精密的Xtra血糖监测系统（美国雅倍公司）测定小鼠的血糖。在增补的实验程序中，全部使用一篇综述介绍的商用试剂盒测出有关的结果。

全血细胞计数和细胞因子

全血细胞计数，使用深圳迈瑞公司兽用BC-2800血液分析仪，根据制造商的程序进行测定。简言之，从尾静脉把血液采进被肝素包被的微量血容管。20微升肝素化血液被加到临床诊断溶液中稀释，然后评估全血参数。细胞因子，用悬液芯片细胞因子测试仪（生物-拉德公司），遵循制造商推荐的方法进行血清分析。

超声心动图

小鼠用2%异氟烷麻醉，剃除左半侧胸部体毛。把小鼠放置在加热温控垫上，连续地监测心率（400-500次/分）。使用超声波传输胶（帕克实验室），在胸骨旁短轴查看心脏的影像。在乳头状肌水平处，用高分辨率Vevo 770超声系统（可视超声公司），获得2维B型影像，并用Vevo 770 2.2.3 软件分析（可视超声公司）。

X线计算机断层扫描

把吸入性异氟烷放在小鼠（代表平均体重的）背部的一个固定位置，进行麻醉。由于延长了麻醉时间，麻醉室中只放3只小鼠，把老年小鼠意外死亡的风险降到最低。双侧股骨骨组织的矿物质密度（羟基磷灰石mg/cm3），使用西门子Inveon CT扫描仪测定，每组5只小鼠。增补实验程序中，对此有详细的描述。

骨髓采集和分析

骨髓细胞从alpha-MEM培养基（Corning Collgro公司）中的小鼠股骨和胫骨里收获。采集的小鼠新鲜骨髓细胞用PBS洗涤后，根据制造商的指示，以特定谱系、Scal、C-试剂盒和溴脱氧尿苷抗体（BD生物科学公司）染色。使用BD FACS diva软件在LSRⅡ流式细胞仪上进行分析。在人外周血液单核细胞亚群中的lin-CD184+CD45-间充质细胞/祖细胞，使用人造血谱系异硫氢酸荧光素混合物、抗人CD45 APC和抗人CD184-PE（eBioscience公司，#22-7778-72，#17-9459-42，#12-9999-42）进行鉴定。

免疫组强化学

为了检测造血细胞的生成，在采集骨髓前24小时，把2%滤过无菌的溴脱氧尿苷（10㎎/ml原液，Sigma公司）按200㎎/㎏体重的一个单剂量注入小鼠腹腔。为了分析成年小鼠的神经生成，在FMD之前，按50㎎/㎏体重的剂量连续3或4天给小鼠注射溴脱氧尿苷（BrdU）。按照增补实验程序中的描述，对BrdU、ki67蛋白、胚胎干细胞关键蛋白（Sox2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、和双肾上腺皮质激素进行染色。

免疫印迹

增补实验程序中有详细描述。

qPCR(定量聚合酶链反应)

相对转录水平，由定量实时PCR进行测定，这在增补实验中有描述。

Y迷宫

每组11只小鼠在23月龄时进行测试。自发交替行为记分，被用于计算交替（单臂选择不同于先前的双臂选择）对交替总数的比例。

加速旋转

小鼠23月龄时，每组18只，使用加速旋转法进行评估。记录旋转速度和旋转后掉下来的时间。连续两天，每天对小鼠进行3次连续试验，两天共试验6次。用两个变量测定小鼠耐受旋转的性能：整个两个连续试验日中，个体最佳性能的平均，和在6次试验中每个处理组小鼠保留平衡的平均时间，作为训练指数。

新物体的识别

测试，由每个5分钟的两个试验区组成。第一个试验（T1）期间，测试装置中含有两个相同的物体。经过延迟1个小时的间隔后，进行第二个试验（T2），把小鼠放回测试装置，此时装置中的两个物体，一个是原来熟悉的，一个是新的。人工记录T1和T2期间小鼠对每一个物体探索所化费的时间。以秒为单位记录熟悉物体和新物体之间所化的探索时间，用来计算识别指数。

巴恩斯迷宫

每组12只23月龄小鼠，每天测试2次，共测试7天。成功率（100%，2分钟内找到逃逸箱[EB]；0%，2分钟内找不到EB），延迟（延迟进入EB），差错的次数（向假洞偏头和伸进鼻子），偏离（有多少首次偏离EB洞）和记录所采取定位EB的策略，及从两次测试得到测试的日平均值。搜索策略的分类，随机（跨过迷宫中心），连续（顺时针或逆时针方向搜索），或立体的（控制方向到达EB的差错或偏差不超过3次记分）。第14天，评估一次保持记忆的情况。

酵母间歇性禁食

酵母细胞快速地从冰库拿出放入YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基）盘，在30℃孵育2天。接着，把3-5个酵母菌落接种于2ml液态电解质中孵育过夜。把过夜的100ul培养液加入50ml长颈瓶的10ml新鲜电解质液中，30℃孵育3天。第3天，把稀释的培养物涂布到YPD平板上，以评估活酵母细胞的数量。余下的培养物减慢转速，移除培养基，颗粒用无菌蒸馏水洗涤2次之后，再悬浮于长颈瓶中的10ml无菌蒸馏水孵育2天。第5天，稀释的培养物再涂布于YPD平板上，余下的培养物再成颗粒，悬浮于10ml无效培养基，孵育48小时。每2天重复交替地用蒸馏水和无效培养基处理，直到活酵母低于原初培养物的10%为止。

制备无效培养基，把3-5个菌落放5ml电解质液中过夜。500ul过夜的培养物加入500ml长颈瓶中的200ml SDC中，在定轨摇床中孵育4天。孵育期之后，培养物用0.22mm过滤器过滤，供实验期中使用。

统计分析

所有的数据，均以平均数±标准误表示。对小鼠的所有统计分析是双面的，P值﹤0.05，差异是显著的（﹡P﹤0.05,﹡﹡P﹤0.01,﹡﹡﹡P﹤0.001）。组间差异使用以下的方法进行测定，或者学生T检验比较，接着杜奇多重比较后进行单向方差分析，或者用GraphPad Prism V.5.软件进行双向方差分析（对于巴恩斯迷宫）。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon 测试进行Kaplan-Meier生存曲线的比较。竞争风险分析被用来进行死亡率统计差异的评估。受试人，使用威尔森符号等级鉴定进行统计分析，其P值﹤0.05被认为显著（﹡P﹤0.05，﹡﹡P﹤0.01，﹡﹡﹡P﹤0.001）。