许多高价值蛋白靶点由于其结构无序、缺乏可供小分子结合的构象，导致针对这些靶点的新药开发困难重重。如何解决这些具有无序结构蛋白的成药难题并为患者提供更多治疗选择，成为了医药行业的关注焦点。

去年1月，一家专注于分子胶产品开发的新锐Ambagon Therapeutics完成了8500万美元的A轮融资，该公司旨在通过开发分子胶，稳定内在无序蛋白（intrinsically disordered proteins）的结构，靶向传统认为“不可成药”的蛋白靶标。作为该领域的新生力量代表之一，Ambagon Therapeutics公司的首席科学官Nancy Pryer博士受邀参加了2023药明康德全球论坛，分享了她对于新药开发的洞见。Pryer博士表示，“靶向蛋白降解剂等新治疗模式的潜力尚未在临床开发中得到充分开发，目前它们仍然靶向一些已经有小分子药物靶向的靶点。”她认为业界应该尽快将这些技术用于攻克不可成药靶点，充分发挥它们的潜力。

Ambagon公司聚焦于一类名为“14-3-3”的衔接蛋白（adaptor protein），14-3-3蛋白被发现与几千种具有内在无序结构的蛋白相互作用，通过结合并诱导这些蛋白形成稳定的结构，14-3-3蛋白可以赋予它们成药性。近日，知名学术期刊Molecular Cell发表了加拿大多伦多大学（University of Toronto）的研究成果，研究人员利用定量蛋白组学技术绘制了7种14-3-3同源蛋白和与其产生相互作用的蛋白质组，并进一步阐明14-3-3是如何参与调控蛋白活动（如蛋白聚集、相分离），以及它对细胞功能产生的潜在影响。

14-3-3是一个进化上高度保守的蛋白质，可识别并参与调控与其相互作用蛋白的线性磷酸化基序（motif），使得其他蛋白的无序结构域变得有序，从而创造出小分子识别所需的结构特征。14-3-3可以与成百上千个结构和功能多样化的蛋白相互作用，并借此调控信号转导、细胞凋亡、转录、蛋白质运输和细胞骨架组装等活动。细胞内多个重要生理活动的背后都有着14-3-3的身影，因此当它出现功能失调导致与其他蛋白质之间的相互作用异常时，可能会引起神经退行性病变和癌症等疾病的发生。

从药物开发的角度看，通过创建可以稳定14-3-3和其它蛋白所形成的复合体结构的分子胶，不仅可以放大蛋白相互作用的结果（比如抑制蛋白的疾病驱动活性、增强或稳定蛋白活性、以及促进疾病驱动蛋白的降解），还有助于小分子药物与14-3-3互作蛋白之间的结合从而增强其药效。考虑到14-3-3互作蛋白之中有相当一部分蛋白成药难度较大，因此深入了解14-3-3相关蛋白互作网络对于药物开发有着重要的意义，同时还可以揭示相关疾病背后的病理学机制。

14-3-3蛋白几乎在所有的真核生物中都有表达，并且存在不止一种同源蛋白形式。既往的研究都集中在单个或少部分同源物上，并没有进行系统性的研究。为此，这篇Molecular Cell研究旨在系统性地分析各同源物蛋白旗下“蛋白互作组”之间的交互作用。

从蛋白结构上看，与14-3-3结合的蛋白的结构更加无序（disordered）并且在热力学和代谢上不太稳定，其中部分序列的特征与形成朊病毒样结构或相分离的倾向相关。此外，这些底物蛋白中有相当一部分为RNA结合蛋白以及核糖核蛋白颗粒结合蛋白，提示14-3-3很可能通过与底物的相互作用影响着DNA的转录过程。在文中，研究人员把蛋白结构的本征无序态和相分离倾向列为14-3-3互作蛋白的两大突出特征。

14-3-3蛋白互作网络涉及了信号传导、细胞分裂、细胞骨架组装和细胞粘附等多种生理活动。既往研究表明，各个14-3-3同源体有着独特的蛋白相互作用偏好，一些分子（如RAF激酶）几乎与所有的14-3-3同源体存在相互作用，表明各14-3-3同源体及其互作蛋白共同构成了一个相互独立却又彼此交叉联结的网络。

为了更加直观地展示14-3-3的作用，研究人员采用编码14-3-3的竞争性抑制剂difopein的融合蛋白质粒转染Hela细胞，以破坏14-3-3和其底物蛋白之间的作用。在转染了difopein载体的细胞中，39%的转染细胞内的蛋白定位发生了变化，表明14-3-3在调节与其结合的蛋白的胞内定位方面发挥着核心作用。不仅如此，抑制14-3-3还影响了这些蛋白的聚集状态。在大多数情况下，破坏14-3-3的蛋白间相互作用会导致细胞内蛋白聚集所形成的“蛋白灶（foci）”数量增加，或是将胞内零散分布的蛋白灶转变为更加聚集的点状排布形式。反之，当14-3-3蛋白被过量表达时，含有蛋白灶结构的细胞数量显著减少，譬如实验中观察到14-3-3γ过表达几乎完全消除了RNA结合蛋白SAMD4A所形成的蛋白灶结构。

进一步研究显示，14-3-3不是通过改变蛋白表达水平来控制细胞内蛋白的定位。综合研究中的其他数据，研究人员判断伴侣样蛋白活性或许才是14-3-3蛋白的主要功能。

下一步，研究人员想知道如果迫使蛋白质与14-3-3相互作用会发生些什么，于是他们将14-3-3的蛋白结合基序植入几种已知在体外和细胞内会发生聚集或相分离的蛋白质的末端。在天然状态下，这几种蛋白质不会与14-3-3蛋白相互作用，但当它们被植入14-3-3的结合基序后，它们会自发与14-3-3发生互动。在同时过表达14-3-3γ的情况下，被植入14-3-3结合基序的蛋白的聚集程度显著降低，并伴随着蛋白溶解度的上调。

最后，研究人员探究了14-3-3对于RNA结合蛋白（RBP）的影响，以探究14-3-3在DNA转录过程中所起的作用。RBP是一类与RNA分子结合并在基因表达转录后调控中发挥作用的蛋白，对于维持细胞正常功能至关重要。研究人员选择了转录抑制因子SAMD4A作为研究对象，与其他蛋白中的研究结果一致，当14-3-3的蛋白结合能力丧失时，SAMD4A聚集所形成的蛋白灶数量显著增加，并且分布更加密集。对下游mRNA转录产物的分析显示，14-3-3负向调控了SAMD4A的转录抑制活性，但它对于SAMD4A的RNA结合偏好没有影响。

总言之，本研究结果表明，14-3-3蛋白在人类细胞中发挥了伴侣样分子的作用，它负向调控了其底物蛋白的聚集和相分离。通过生物化学手段促使14-3-3靶向其非天然底物蛋白可以抑制这些底物蛋白在体内/外聚集的倾向。14-3-3已被证实参与了多种致病性蛋白聚集体的形成，而这些聚集体很可能导致蛋白质错误折叠相关疾病，因此通过稳定现有的14-3-3/底物相互作用，或是诱导14-3-3与全新的底物发生相互作用具有潜在的治疗应用价值。已有研究发现，利用分子胶可以选择性地稳定14-3-3和特定底物之间的相互作用。这种治疗策略可以针对内在无序的蛋白质进行药物干预，而这类携带无序结构域的蛋白一直是众所周知的难以成药靶点。本研究对于14-3-3伴侣样分子作用的深入解析将为这类全新疗法的开发提供新的理论支撑。

参考资料：
[1] Segal, Dmitri et al. “A central chaperone-like role for 14-3-3 proteins in human cells.” Molecular cell vol. 83,6 (2023): 974-993.e15. doi:10.1016/j.molcel.2023.02.018