蛋白质领域内的构象变化表明，突变可以产生超精确的cas9

来源：

加利福尼亚大学伯克利分校

梗概：

一项详细的研究表明，当分子与DNA结合时，Cas9蛋白的结构是如何移动的，这使得科学家能够定位检测Cas9单导RNA和其DNA目标之间的粘结性的蛋白质。研究人员随后调整了这一领域，以提高特异性，创造了迄今为止最高的富达Cas9蛋白。

Cas9蛋白(灰色)是一种rna引导核酸酶，可以编程来绑定和切割任何匹配的DNA序列(深蓝色双螺旋)，使其成为基因组工程的强大工具。在目标结合上，Cas9蛋白域进行构象重组(单个氨基酸的运动以火箭尾为代表)，激活Cas9 - sgrna复合体，用于靶向分裂。REC3域(teal)负责目标感知，这标志着REC2域(洋红)的外部旋转为HNH核酸酶域(黄色)打开了一条路径。这种Cas9的活性构象能够触发目标DNA链的协同分裂。

来源： Janet Iwasa摄于Doudna实验室

加州大学伯克利分校和马萨诸塞州综合医院的科学家已经确定了一个Cas9蛋白质内的关键区域，它决定CRISPR-Cas9导向追踪目标DNA序列的准确性,并调整其产生超精度基因编辑，同时其切割脱靶达到目前最低水平。

研究人员说，他们认为，作为DNA切割主控制器的蛋白质结构，是重新设计提高准确性的明显目标。这种方法应该帮助科学家定制Cas9的变体——即结合和切割DNA的蛋白质——以尽量减少crispr - Cas9在错误的地方编辑DNA，这是在人类进行基因治疗的关键考虑因素。

提高准确性的一种策略是在称为REC3的控制蛋白结构中创建突变，并观察哪些突变在不影响目标切割效率的情况下提高准确性。

“我们发现，在Cas9的REC3结构，即使是微小的改变也会影响到目标与非目标编辑之间的差异，这表明该结构显然是提高目标特异性、诱导深入突变的候选者。”作为这项工作的延伸，我们可以在REC3中执行比我们所做的目标突变更不带偏见的诱变，”联合第一作者Janice Chen说，她是Jennifer Doudna实验室的一名研究生，她和其他人共同发明了crispr - cas9基因编辑工具。

联合第一作者Chen, Yavuz Dagdas和Benjamin Kleinstiver以及他们在加州大学伯克利分校、马萨诸塞州总医院和哈佛大学的同事们在《自然》杂志上发表了他们的研究成果。

超精度Cas9

自2012年以来,加州大学伯克利分校分子和细胞生物学教授、霍华德休斯医学研究所研究员Doudna,和同事Emmanuelle Charpentier在马克斯·普朗克传染病研究所转化Cas9蛋白，开发出一种廉价、准确和易于使用的基因编辑工具,研究人员试图减少非目标编辑的可能性。虽然提高保真度对基础研究有好处，但在为临床应用程序编辑基因时，它绝对是至关重要的，因为任何偏离目标的DNA切割都可能使关键基因失效，并导致永久性的、意想不到的副作用。

在过去的两年里，两支队伍设计出了高度精确的Cas9蛋白——一种特异性增强，叫做eSpCas9(1.1)，一种具有高保真度，叫做spcas9 - hf1——Chen和 Doudna试图了解为什么它们比野生型Cas9蛋白在今天广泛使用的链球菌中具有更高的特异性。

目前，研究人员使用crispr - Cas9制造一种单导RNA(sgRNA)——一种RNA分子，其中包括一串20个核糖核酸链，它可以与特定的20个核酸DNA序列相辅相成，并将其附在Cas9上。这个向导RNA允许Cas9导向追踪互补的DNA，与它结合并切断双链螺旋。但是，cas9 - sgrna复合体也可以与DNA相结合，但它与DNA不完全吻合，导致人们不希望出现的脱靶。

2015年，Doudna的实验室发现了Cas9的构象开关，当RNA引导和DNA目标匹配时激活。他们发现，只有当RNA和DNA匹配时，Cas9的三维结构，特别是HNH核酸酶结构的构象，才会改变和激活Cas9的剪刀。然而，在构象开关上游感知核酸的过程仍然未知。

在目前的研究中，Chen和Dagdas使用了一种叫做单分子FRET (Frster resonance energy transfer第一共振能量转移)的技术来精确测量cas9 - sgrna蛋白质复合体中的各种蛋白结构，特别是REC3、REC2和HNH，当复杂的蛋白质与DNA结合时，它们会移动。

他们首先确定了eSpCas9(1.1)和spcas9 - hf1所赋予的特异性益处可以用事实来解释，即对于这些Cas9变体来说，HNH构象开关的阈值要比野生型Cas9蛋白高得多，使eSpCas9(1.1)和spcas9 - hf1变体在绑定到非目标序列时更不可能激活剪刀。

接下来，他们发现REC3结构负责感知目标绑定的准确性，然后号令REC2结构外旋，为HNH核酸酶域打开路径，激活剪刀。这种Cas9的活性构象能够将目标DNA的两条链裂解。

Chen,Dagdas和kleUNK ver则表明，通过突变部分的REC3，可以改变Cas9蛋白的特异性，使HNH核酸酶没有激活，除非引导RNA和目标DNA匹配非常接近。他们能够设计出一种经过改良的超精确的Cas9，它被称为“HypaCas9”，它能保持目标的效率，但在人类细胞中与非目标位点之间的区别上略有提高。

“如果你在REC3中对某些氨基酸残留物进行变异，你可以调整Cas9在目标活动之间的平衡，并提高特异性;我们能够找到在预定目标上有足够活动的最佳地点，同时也能减少非目标事件。” Chen说。

通过继续探索Cas9的结构、功能和动力学之间的关系，Doudna和她的团队希望能进一步设计出一种具有搞灵敏度的蛋白质，以可靠和有效地执行多种基因改变。